探究可溶性硝酸盐传感器ScNreA的阴离子结合广谱性机制及其构象动力学基础

为解决蛋白质阴离子识别中的广谱性机制问题，研究人员以金黄色葡萄球菌硝酸盐感应蛋白ScNreA为模型，通过热力学、动力学及分子动力学模拟揭示其结合偏好性（硝酸盐>碘化物>亚硝酸盐）主要由解离速率调控，并发现构象可塑性及局部疏水环境变化是关键驱动因素。该研究为理解生物阴离子识别提供了多尺度视角。

　　

在生物系统中，蛋白质对无机阴离子的识别在信号转导、代谢调节和物质转运等过程中扮演着关键角色。传统观点认为，蛋白质通过精确设计的非共价相互作用（如精氨酸残基和主链酰胺）与阴离子的物理性质（如尺寸、形状、电荷和脱水焓）匹配，实现高选择性识别。然而，自然界中同样存在一类表现出“广谱性”（promiscuity）的蛋白质，它们能够结合多种阴离子，例如碳酸酐酶和氯离子通道。这种广谱性的分子机制及其生物学意义尚未被充分揭示。

为了解决这一问题，研究团队选择来自食物级细菌Staphylococcus carnosus的硝酸盐感应蛋白NreA（ScNreA）作为模型系统。ScNreA是NreABC调控系统的组成部分，在厌氧条件下通过感应硝酸盐触发细菌的代谢重组。早期的X射线晶体结构研究表明，ScNreA不仅能结合其天然配体硝酸盐（NO₃^?）和亚硝酸盐（NO₂^?），还能结合非生理性的碘化物（I^?），暗示其具有一定的识别广谱性。然而，这种广谱性的热力学与动力学基础，以及其如何与生理功能协调，仍不清楚。

本研究通过整合等温滴定量热法（ITC）、停流荧光光谱和分子动力学（MD）模拟，首次全面揭示了ScNreA与三种阴离子（NO₃^?、I^?和NO₂^?）结合的机制。研究发现，ScNreA对阴离子的结合偏好性（NO₃^? > I^? > NO₂^?）主要由解离速率（k_off）而非结合速率（k_on）决定。进一步的结构动态分析表明，阴离子结合过程中蛋白质的构象可塑性及局部疏水环境的变化是驱动选择性差异的关键因素。这一工作不仅深化了对阴离子识别机制的理解，也为设计新型生物传感器提供了理论依据。相关成果发表于《Communications Chemistry》。

研究主要采用了以下技术方法：通过原核表达系统制备重组ScNreA蛋白；使用等温滴定量热法（ITC）在10–25°C范围内测定结合热力学参数；利用停流荧光光谱技术以色氨酸残基（W45）荧光为探针测量结合与解离动力学；结合分子动力学（MD）模拟在原子水平上分析阴离子进出结合口袋的路径及蛋白质构象变化。

Thermodynamic characterization

ITC实验表明，ScNreA与三种阴离子的结合均为放热过程，且由焓变（ΔH）主导。结合亲和力排序为NO₃^?（K_d ≈ 4 μM） > I^?（K_d ≈ 44.5 μM） > NO₂^?（K_d ≈ 109 μM）。值得注意的是，NO₃^?结合伴随较大的负热容变化（ΔC_p ≈ ?308.2 J/mol·K），提示结合后疏水表面被屏蔽；而I^?结合显示正ΔC_p值（242.3 J/mol·K），表明非极性表面暴露于水环境中。

Kinetic characterization

停流荧光动力学实验揭示，结合速率（k_on）差异较小（NO₃^? ≈ 2.70 × 10⁵ M^?1s^?1，NO₂^? ≈ 1.82 × 10⁵ M^?1s^?1），但解离速率（k_off）差异显著：NO₃^?的解离比NO₂^?慢7倍。这表明解离动力学是亲和力差异的主要决定因素。

In silico characterization

MD模拟显示，三种阴离子通过同一路径进出结合口袋，频率和停留时间各异。结合过程涉及静电锚定（如R62和K65）、主链酰胺（G66-L67、L67-A68、P96-I97）及W45侧链的协同作用。水分子的动态参与及局部非极性残基（如L61、Y95）的疏水效应进一步调节结合稳定性。根均方波动（RMSF）和主成分分析（PCA）表明，阴离子结合后蛋白质柔性环区（残基84–94）运动发生特异性改变，且每种阴离子诱导独特的全局构象状态。

本研究通过多尺度策略揭示了ScNreA的阴离子识别广谱性机制：其结合偏好性由解离动力学主导，而构象可塑性及溶剂-蛋白质界面变化是调控选择性的关键。值得注意的是，尽管ScNreA在体外显示广谱结合能力，其在生理环境下仍优先响应硝酸盐，从而保障细菌代谢调控的特异性。这一发现扩展了对蛋白质-阴离子相互作用的理解，提示广谱性可能是硝酸盐结合蛋白的普遍特征，其实现依赖于结合口袋的化学组成、蛋白质整体折叠及动态构象变化。未来工作可进一步探索其他阴离子的结合模式，并建立理论模型以预测广谱性识别规律。该研究为理性设计阴离子响应蛋白提供了重要启示，尤其在生物传感和合成生物学领域具有应用潜力。