加纳北部无症状携带者中疟原虫高季节性传播的宏基因组复杂性研究揭示感染多样性与防控新策略

为解决高疟疾负担地区无症状感染者中混合虫种/虫株感染的复杂性被低估问题，研究人员在加纳北部开展了一项基于可变采血量的宏基因组学研究。结果表明，大体积血样（100μL pRBC）显著提高了Plasmodium spp.的检出率和多虫种/虫株感染复杂性（如Pf-MOI、Pm-MOI），揭示了当前监测方法（如DBS）的局限性。该研究为优化疟疾监测与控制策略提供了关键科学依据，对推动撒哈拉以南非洲地区消除疟疾具有重要意义。

　　

在疟疾高流行的撒哈拉以南非洲地区，人群普遍存在无症状感染，这些感染者成为维持疟疾传播的关键 reservoir（储存库）。然而，当前针对无症状感染的监测主要依赖小体积干燥血斑（DBS）采样，可能严重低估了感染中疟原虫虫种和虫株的复杂性。混合虫种（如Plasmodium falciparum、P. malariae、P. ovale curtisi 和 P. ovale wallikeri）及虫株的共感染现象常见，但其真实规模尚未在高传播区得到系统评估。这一问题制约了疟疾消除策略的精准实施，因此亟需通过更灵敏的宏基因组学方法揭示感染复杂性。

为了深入探究这一问题，研究人员在加纳北部的Bongo地区（高季节性传播区）开展了横断面研究，纳入了188名无发热症状的居民（年龄6-90岁），采集了静脉全血和DBS样本。通过比较不同体积 packed red blood cells（pRBC，1μL、10μL、50μL、100μL）与标准DBS的检测效果，结合多种分子技术（如物种特异性18S rRNA PCR、var基因DBLa标签测序（varcoding）、微卫星分型（P. malariae）和potra基因分型（P. ovale spp.），全面评估了感染 prevalence（流行率）、multiplicity of infection（MOI，感染复数）和 metagenomic complexity（宏基因组复杂性）。

研究的关键技术方法包括：物种特异性18S rRNA PCR鉴定Plasmodium种属；varDBLa标签扩增子测序（varcoding）用于P. falciparum的MOI估计和群体多样性分析；微卫星分型（12个位点）评估P. malariae的遗传多样性；potra基因半巢式PCR区分P. ovale curtisi和P. ovale wallikeri并估计其MOI；血浆PfHRP2浓度测量（ELISA）辅助验证感染；统计建模（如广义加性模型）分析MOI随血体积变化的非线性关系。样本来源于加纳Bongo地区的地方性人群队列（2020年11月采集）。

更高体积的采血显著提升疟原虫种属和混合感染的检出率

通过比较100μL pRBC与DBS的18S rRNA PCR结果，发现大体积采样使P. falciparum、P. malariae和P. ovale spp.的检出率分别提高1.32倍、1.93倍和2.50倍（p<0.0001），且双虫种和三虫种感染的比例显著增加。P. vivax在所有样本中均未检出，与西非Duffy阴性人群的遗传保护一致。varcoding数据进一步证实，100μL pRBC较1μL pRBC的P. falciparum检出率提高1.36倍。

大体积采样揭示更高的P. falciparum感染复数（Pf-MOI）和群体多样性

基于varDBLa标签的Pf-MOI估计显示，100μL pRBC的中位Pf-MOI为3，显著高于1μL pRBC的中位值1（p<0.0001）。非线性模型表明，Pf-MOI的 fold difference（FD_Pf-MOI）随初始小体积Pf-MOI值的变化呈非线性关系，提示小体积采样（如DBS）对低复杂度感染（Pf-MOI=1-3）的低估最为明显。大体积采样不仅增加了 isolate repertoire size（分离株库大小），还检测到大量未被小体积采样捕获的DBLa类型（占总数44.8%），但 isolate 间遗传相似性（PTS）始终较低，表明感染主要由高度多样化的虫株组成。

多虫种感染的宏基因组复杂性及极端复杂感染个体的发现

对100μL pRBC样本的整合分析显示，感染类型包括单虫种、双虫种和三虫种感染，且各虫种内部MOI水平多变（如P. malariae中位Pm-MOI=2，范围1-4）。 summation of MOI across species（跨虫种MOI总和）定义的 metagenomic complexity 揭示，5.85%（11/188）的个体携带极端复杂感染（总MOI 10-23），这些个体同时感染多达20种P. falciparum抗原变异株、4种P. malariae基因型及1-2种P. ovale虫株。极端复杂性与年龄、性别或地理位置无显著关联，其成因需进一步研究。

对疟疾监测和消除实践的启示

通过将DBS数据校正至100μL pRBC等效值，并 scale up 至Bongo地区（102,004人）和上加纳东部大区（1,100,676人）的人口规模，预测当前DBS采样会漏检数万至数十万例Plasmodium spp.感染。校正后P. falciparum普查种群规模（census population size）显著扩大，凸显了 reservoir 中寄生虫多样性的规模。研究强调，在 high-transmission areas（高传播区）的哨点监测中，需结合“shallow but broad sampling”（广覆盖浅采样）和“deep but restricted sampling”（深采样窄覆盖）策略，以准确捕捉种群水平的多样性和复杂性。

该研究结论表明，无症状感染者中疟原虫感染的宏基因组复杂性远高于当前监测体系的认知，大体积采血是提升监测灵敏度的关键。这一发现对优化疟疾消除策略（如针对 reservoir 的干预、抗药性监测和疫苗评估）具有直接 translational significance（转化意义）。研究结果发表于《Communications Medicine》，为高负担地区的疟疾基因组 surveillance（监测）提供了方法论范式和数据支撑。