氨基酸稳定蛋白质和胶体分散体系的机制：弱相互作用介导的普适性胶体稳定效应

本研究针对氨基酸(AA)稳定生物制剂的机制不明问题，通过多尺度实验和理论建模，揭示了氨基酸通过弱吸附作用屏蔽纳米胶体表面斑块(patch)的普适性稳定机制。研究发现氨基酸能显著提高第二维里系数(B22)和平均力势(PMF)，理论模型预测并经实验验证了带电氨基酸的选择性作用、短肽的协同效应及小分子的通用稳定能力。该发现对生物制剂开发、细胞应激响应和蛋白质相分离调控具有重要指导意义。

　　

在生物医药领域，蛋白质药物的稳定性始终是制约其临床应用的关键瓶颈。氨基酸作为常用的制剂辅料，虽已被广泛使用数十年，但其稳定机制却一直笼罩在迷雾之中。传统观点认为氨基酸可能通过影响水分子结构、发挥助溶作用或特异性稳定蛋白质折叠状态来发挥作用，但这些假说都未能解释其作用的普适性规律。更根本的是，科学界甚至无法确定这种稳定作用究竟是蛋白质特有的生物学效应，还是适用于更广泛胶体体系的普适性物理化学原理。

为了解决这一基础性问题，来自瑞士洛桑联邦理工学院、美国麻省理工学院和中国南方科技大学等机构的研究团队在《Nature》发表了突破性研究成果。研究人员通过多学科交叉方法，综合运用分析超速离心沉降平衡(AUC-SE)、自相互作用色谱(SIC)、冷冻电镜(cryo-EM)和荧光光谱等技术，结合理论建模和生物学验证实验，系统阐明了氨基酸稳定胶体分散体系的分子机制。

研究采用的关键技术方法包括：通过分析超速离心沉降平衡和自相互作用色谱定量测定第二维里系数(B₂₂)的变化；利用冷冻电镜技术解析金纳米粒子和铁蛋白的平均力势(PMF)；采用荧光光谱法直接测量氨基酸-蛋白质结合常数；通过云计算点实验研究液相分离行为；并利用细胞模型和小鼠体内实验验证生物学意义。

Stabilization of colloidal dispersions by AAs

研究人员首先通过设计巧妙的对比实验，探究氨基酸对蛋白质和非生物纳米粒子的稳定作用是否遵循相同规律。他们选择表面修饰疏水和亲水配体的金纳米粒子(AuNPs)作为模型非生物胶体，因其不存在蛋白质特有的错误折叠问题。通过冷冻电镜测量不同浓度下的平均力势，发现无论是蛋白质(铁蛋白)还是金纳米粒子，添加脯氨酸后都表现出相似的稳定化效果——势垒高度增加而势阱深度基本不变。这表明氨基酸的稳定作用确实是一种普适的胶体现象，而非蛋白质特异性效应。

为量化这种稳定效果，研究团队采用两种独立方法(AUC-SE和SIC)测量第二维里系数(B₂₂)的变化。结果显示，添加氨基酸后所有测试体系(溶菌酶、牛血清白蛋白、脱铁铁蛋白、FUS低复杂结构域、质粒DNA和金纳米粒子)的ΔB₂₂均大于零，表明净排斥作用增强。特别值得注意的是，这种效果在低至10 mM的氨基酸浓度下即可检测到，且与蛋白质/氨基酸化学计量比无关，只取决于氨基酸的绝对浓度。

Theoretical framework and its validation

基于实验发现，研究人员提出了一个创新的理论框架来解释氨基酸的稳定机制。该模型将蛋白质(或广义胶体)视为斑块粒子(patchy particles)，表面存在多个可发生吸引作用的斑块区域。氨基酸通过弱相互作用吸附到这些斑块上，部分屏蔽了胶体间的吸引力。吸附过程遵循朗缪尔等温线，而胶体稳定性则在平均场水平上进行评估。

该理论推导出一个简洁的数学表达式：ΔB₂₂ = (a³ - B₂₂⁰) × (Kc/(1+Kc)) × f_max，其中a³为有效排除体积，B₂₂⁰为无氨基酸时的第二维里系数，K为结合常数，c为氨基酸浓度，f_max为最大覆盖分数。这一公式成功拟合了所有实验数据，并产生了三个重要预测：带电氨基酸只对相反电荷的蛋白质有效；由n个氨基酸组成的短肽效果不低于n个单独氨基酸；任何与纳米胶体弱相互作用的小分子都能通过相同机制产生稳定效果。

实验验证完全证实了这些预测。通过直接测量结合常数与理论拟合值的比较(如脯氨酸-溶菌酶体系的K_D分别为1.12 M和2.28 M)，发现两者高度一致。更重要的是，研究人员发现非生物分子1,1,1-三(羟甲基)乙烷(TME)也能产生类似的稳定效果，进一步证明了该机制的普适性。分子动力学模拟和核磁共振实验则从原子水平揭示了氨基酸优先吸附于蛋白质表面特定"热点"区域，为理论模型提供了分子基础。

Biological effects

研究的最后部分探讨了这一发现的生物学意义。通过云计算点实验，研究人员证明氨基酸添加显著改变了溶菌酶的相图，使液-液相分离(LLPS)边界线下移达4K。在细胞水平上，200 mM脯氨酸预处理显著减少了热应激诱导的应激颗粒形成。更令人印象深刻的是，在胰岛素制剂中添加1 M脯氨酸后，小鼠体内实验显示其生物利用度提高了一倍，血药浓度-时间曲线下面积(AUC)从63.6±22.6 ng ml^?1 min^?1增加到122.5±40.1 ng ml^?1 min^?1。

这些发现表明，氨基酸通过弱相互作用调控蛋白质-蛋白质相互作用的机制在生物体系中具有广泛重要性。从细胞应激响应到病毒复制(实验显示谷氨酰胺显著抑制疱疹病毒2型复制)，再到蛋白质制剂稳定性，这种弱相互作用产生的强效应可能影响着众多生物学过程。

本研究从根本上改变了人们对氨基酸稳定作用的理解，揭示了其作为一种普适性胶体稳定机制的物理本质。理论框架的建立不仅解释了现有现象，更成功预测了新的实验现象，展示了强大的解释和预测能力。研究发现弱相互作用能够产生显著的生物学效应，这对药物制剂开发、蛋白质工程和细胞生物学研究都具有重要指导意义。特别值得注意的是，这种稳定机制的强度与离子强度的作用相当但效果相反，表明在生物物理实验中，小分子添加剂的影响应与离子强度一样被重视和报告。

这项工作为理解细胞内高浓度氨基酸和短肽的生物学功能提供了新视角，也为合理设计生物制剂配方奠定了理论基础。从更广阔的视角看，它展示了物理化学原理与生物学现象之间的深刻联系，为跨学科研究提供了杰出范例。