利用波动DNA甲基化追踪癌症演化：EVOFLUx方法在临床规模揭示淋巴瘤进化动力学

为破解癌症演化动态追踪难题，研究人员开发了EVOFLUx方法，通过分析肿瘤DNA甲基化组中自然波动的CpG位点(fCpGs)，仅需单次批量甲基化数据即可定量推断肿瘤进化历史。应用于1,976例淋巴瘤样本，发现初始生长速率、恶性肿瘤年龄和表观突变率在不同疾病类型间差异显著，进化历史是慢性淋巴细胞白血病(CLL)的独立预后因素，甚至检测到Richter转化克隆在临床发病前数十年就已存在。该方法为低成本、大规模测量肿瘤进化动力学提供了创新平台。

　　

癌症的发展和治疗反应本质上是一个进化过程，然而在临床相关规模上表征这些进化动态一直面临巨大挑战。传统方法需要纵向样本或单细胞测序，成本高昂且难以广泛应用。近年来，科学家发现某些CpG位点的DNA甲基化会随时间自然波动，这种“波动CpGs”（fluctuating CpGs, fCpGs）就像一种天然的分子条码，能够记录细胞谱系的历史。但是，如何利用这种波动特征来精确量化肿瘤的进化历史，仍是一个悬而未决的问题。

发表在《Nature》的这项研究，由Calum Gabbutt、Marti Duran-Ferrer等科学家领导，开发了一种名为EVOFLUx的新方法，它能够仅利用批量肿瘤甲基化数据，就定量推断出癌症的进化动力学。研究人员将这一方法应用于1,976例经过充分表征的淋巴瘤样本，涵盖了从儿童急性淋巴细胞白血病到成人慢性淋巴瘤的广泛疾病谱系，揭示了不同淋巴瘤类型在初始生长速率、恶性克隆出现时间（恶性肿瘤年龄）和表观遗传突变速率方面存在数量级上的差异。

为了开展这项研究，研究人员整合了来自多个国际队列的2,430例样本的Illumina甲基化阵列数据，经过严格质控后保留了2,204例样本。他们建立了一套计算流程，从约39万个CpG位点中筛选出978个在淋巴细胞中特异性波动的fCpGs。这些位点表现出独特的“斑点状”甲基化模式，与传统的甲基化时钟或随机CpG集合完全不同。通过纳米孔长读长测序、单细胞甲基化测序和匹配的基因组数据，研究团队验证了fCpGs作为进化条码的特性，证实其甲基化变化是等位基因特异性且独立发生的，主要由随机波动驱动，而非遗传变异或选择压力。

研究的关键技术方法包括：大规模甲基化阵列数据的整合与质控（样本来源包括EGAS00001001196、GSE56602等多个公开数据集）；fCpGs的筛选与验证（使用标准差、平均甲基化水平和Laplacian评分等多重过滤）；EVOFLUx数学模型的构建（基于随机过程和贝叶斯推断）；进化参数的推断（包括生长速率θ、最近共同祖先时间τ和表观突变率）；以及通过匹配的全外显子组/全基因组测序数据（EGAS00000000092、EGAD00001008954）进行正交验证。

Characterization of fCpGs in lymphoid cancers

研究人员发现，fCpGs在癌症样本中呈现特征性的“W形”甲基化分布，反映了克隆扩张的历史；而在健康的多克隆B细胞群体中则表现为单峰分布。这些fCpGs富含于CpG岛 shores区域，倾向于位于基因组沉默区域（如弱启动子和增强子），与基因表达调控无关，表明它们是中性的谱系标记。

EVOFLUx measures clonal evolution

EVOFLUx模型将肿瘤进化分为两个阶段：MRCA（最近共同祖先）出现前的单细胞谱系波动阶段和MRCA出现后的指数增长阶段。模型关键参数包括癌症生长速率（θ）、MRCA出现时间（τ）和四个表观遗传转换速率（μ, ν, γ, ζ）。通过贝叶斯推断，该方法能够从单个样本的fCpG甲基化分布中准确估计这些参数，即使存在正常细胞污染和技术噪声。

Evolution of lymphoid malignancies

应用EVOFLUx分析发现，儿科急性白血病（ALL）比成人淋巴瘤生长速率更快（θ更高）、有效群体大小（N_e）更小、MRCA时间更短。成人肿瘤中，单克隆B细胞淋巴细胞增多症（MBL）比CLL生长更慢、历史更久。不同分子亚型也显示出 distinct 的进化模式：MLL重排的B-ALL生长最快，CLL中未突变IGHV（U-CLL）比突变型（M-CLL）生长更快、N_e更大。

Evolution varies by cancer subtype

在CLL中，TP53突变在M-CLL亚型中与更高的生长速率和N_e相关；+12三体在两个亚型中都与更大的N_e相关。这些发现将分子亚型与特定的进化动力学联系起来。

Most lymphoid cancers grow effectively-neutrally

大多数淋巴瘤（1,610/1,976）没有检测到亚克隆选择或独立克隆，表现为“有效中性”进化。CLL中亚克隆检测频率最高（约30%），与WES/WGS数据验证一致性良好。研究发现22例CLL存在两个独立起源的克隆。

fCpGs record clonal dynamics over time

对两名发生Richter转化（CLL向侵袭性淋巴瘤转化）的患者进行长达十多年的纵向分析发现，fCpGs数据清晰地捕捉到了克隆动态变化，与WGS结果高度一致。系统发育分析表明，导致Richter转化的克隆在临床诊断前几十年就已从CLL克隆中分化出来。

Evolutionary history and clinical outcome

在478例CLL中发现，进化历史是强大的独立预后因素。更高的生长速率（θ）与更短的首次治疗时间（TTFT）显著相关（P=1.4×10^-30），即使在控制IGHV状态、TP53异常和年龄的多变量Cox模型中仍保持显著（P=2.2×10^-10）。有效群体大小（N_e）与总生存期（OS）的相关性更强。这些发现在另一个独立队列（209例CLL）中得到验证。

研究结论和讨论部分强调，EVOFLUx首次实现了仅利用低成本、广泛可得的批量甲基化数据就能在临床规模上定量测量癌症进化历史。研究表明，肿瘤的进化动力学与疾病表型和临床结局密切相关，这表明克隆进化这一基本细胞过程决定了疾病的临床进程。这种方法不仅适用于淋巴瘤，理论上也可推广到所有癌症类型，甚至适用于血液中循环肿瘤DNA的分析。这项研究为癌症进化生物学提供了前所未有的洞察力，为精准肿瘤学领域带来了创新性的强大工具，有望在未来改善癌症患者的风险分层和治疗决策。