CD20耗竭疗法通过调节小胶质细胞极化减轻多发性硬化患者血清诱导的脱髓鞘作用

本研究探讨了Ofatumumab（OFT）治疗对多发性硬化（MS）患者外周免疫系统及中枢神经系统（CNS）内胶质细胞的影响。通过分析患者治疗前后血清细胞因子变化，并结合体外小脑切片培养模型，发现OFT治疗可显著降低促炎因子（如CCL2、IL-1β、IL-6、TNF-α等），提升抗炎因子IL-10水平。血清中的TLR4配体减少，小胶质细胞向抗炎表型极化（ARG-1+、IL-10+），从而在LPC诱导的脱髓鞘过程中保护髓鞘结构和少突胶质细胞，并抑制星形胶质细胞增生。这一发现揭示了CD20耗竭疗法通过外周免疫调节间接影响CNS内免疫机制的新途径，为MS治疗提供了新的理论基础。

　　

多发性硬化（Multiple Sclerosis, MS）是一种慢性炎症性脱髓鞘疾病，主要影响中枢神经系统（CNS），其特征包括髓鞘结构丢失、星形胶质细胞增生、小胶质细胞激活和轴突损伤。尽管免疫机制，特别是淋巴细胞异常活动，被认为是导致神经元损伤的主要原因，但大脑固有的免疫细胞——小胶质细胞和星形胶质细胞——在调节炎症和执行非专业抗原呈递中的作用日益受到关注。目前的治疗标准主要基于外周淋巴细胞的免疫调节或免疫抑制，但针对CNS内胶质细胞的治疗策略仍待深入探索。

CD20是一种33–37 kDa的跨膜蛋白，表达于B细胞表面，也存在于一小部分CD3⁺ T细胞中。在自身免疫性疾病如MS中，CD20⁺ T细胞的频率增加，这些细胞通过抗原驱动的自身抗体反应、效应功能以及作为抗体分泌性浆细胞的来源，参与慢性炎症的发展。CD20耗竭不仅影响淋巴细胞，还增加MS中的单核细胞活性。Ofatumumab（OFT）是一种全人源抗CD20单克隆抗体，通过补体依赖性细胞毒性（CDC）和抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC）机制清除CD20⁺细胞，已被批准用于治疗复发型多发性硬化（RMS）。然而，OFT治疗对CNS内胶质细胞（如小胶质细胞、星形胶质细胞和少突胶质细胞）的影响尚不明确。

小胶质细胞在健康和疾病状态下执行大部分免疫细胞功能。在神经炎症期间，小胶质细胞产生一氧化氮（NO）或肿瘤坏死因子（TNF），并与星形胶质细胞形成交叉对话轴，进一步驱动炎症和脱髓鞘。另一方面，小胶质细胞对髓鞘碎片的吞噬对于后续的自发再髓鞘化至关重要。根据其极化状态，小胶质细胞可以缓解或减缓炎症，保护 against 脱髓鞘，或被调节以介导有益的疾病结局。因此，研究CD20耗竭对CNS内胶质细胞的影响，对于理解MS的发病机制和开发新的治疗策略具有重要意义。

本研究旨在探索外周免疫调节通过CD20耗竭对CNS内炎症反应的潜在影响。研究人员采用小鼠小脑切片培养模型，通过暴露于溶血磷脂酰胆碱（LPC）诱导完全脱髓鞘，评估CD20耗竭后患者血清对白质脱髓鞘和胶质反应的调节作用。

研究人员招募了19名RMS患者，在OFT治疗前和治疗6个月后收集血清样本。通过多重酶联免疫吸附 assay（ELISA）分析血清中炎症相关细胞因子的变化。使用小鼠小脑切片培养模型，在LPC诱导脱髓鞘过程中加入患者血清，评估其对髓鞘和胶质细胞的影响。通过免疫组化、实时定量PCR（qRT-PCR）、Griess assay和ELISA等技术，分析小胶质细胞极化、星形胶质细胞激活、少突胶质细胞存活以及相关细胞因子和基因表达的变化。

3.1. CD20耗竭降低MS患者血清中的炎症相关因子

OFT治疗6个月后，患者血清中的促炎细胞因子（如CCL2、IL-1β、IL-6、TNF-α、IFN-γ、IL-12p70、IL-17A、IL-18和IL-23）水平显著降低，而抗炎细胞因子IL-10水平升高。这表明CD20耗竭有效减少了外周免疫系统的炎症反应。

3.2. 内源性TLR4配体 contributes to proinflammatory microglial activation pre-OFT treatment

用OFT治疗前血清刺激BV2小胶质细胞，可诱导更高的NO production，而TLR4抑制剂TAK-242能显著抑制这一效应。这表明治疗前血清中的TLR4配体是小胶质细胞炎症激活的重要驱动因素之一。

3.3. CD20耗竭患者血清减轻LPC诱导的小脑切片脱髓鞘

在LPC诱导的脱髓鞘模型中，OFT治疗前血清导致髓鞘 loss，而OFT治疗后血清不仅自身不引起脱髓鞘，还能防止LPC诱导的髓鞘损伤。实时定量PCR显示，OFT治疗后血清能维持髓鞘碱性蛋白（Mbp）的表达水平。

3.4. CD20耗竭对少突胶质细胞具有保护作用

通过APC染色发现，LPC处理显著减少成熟少突胶质细胞数量，而OFT治疗后血清能 preserve 少突胶质细胞数量，表明其对少突胶质细胞具有保护作用。

3.5. CD20耗竭患者血清对脱髓鞘的保护作用与小胶质细胞相关

小胶质细胞数量在LPC处理后未显著变化，但形态从分支状变为 amoeboid，表明激活。OFT治疗后血清处理的小胶质细胞形态异常，既非分支状也非 amoeboid。使用CSF-1R抑制剂BLZ945减少小胶质细胞后，OFT治疗后血清的保护作用被消除，表明小胶质细胞是保护作用的关键介质。

3.6. CD20耗竭患者血清 prevent LPC诱导的小胶质细胞炎症激活

OFT治疗后血清能显著降低LPC诱导的NO和TNF production，并下调炎症和吞噬相关基因（如Itgax、Il6、Tnf、Trem2、Msr1和Cxcl10）的表达，表明小胶质细胞向抗炎表型极化。

3.7. CD20耗竭患者血清增加抗炎因子表达

OFT治疗后血清能诱导小胶质细胞表达精氨酸酶-1（ARG-1）和IL-10，进一步证实其促进抗炎表型的作用。

3.8. CD20耗竭患者血清抑制星形胶质细胞增生

OFT治疗后血清能减少LPC诱导的星形胶质细胞增生（GFAP染色面积减少），并下调炎症相关基因（如Gfap和Lcn2）的表达，表明其对星形胶质细胞也具有调节作用。

本研究通过分析OFT治疗前后MS患者血清的细胞因子变化，并结合小脑切片培养模型，揭示了CD20耗竭疗法通过调节外周免疫系统，间接影响CNS内胶质细胞功能的机制。OFT治疗显著降低促炎细胞因子水平，减少血清中的TLR4配体，从而抑制小胶质细胞的炎症激活，促进其向抗炎表型极化。这一变化进一步保护少突胶质细胞和髓鞘结构，抑制星形胶质细胞增生，最终减轻脱髓鞘损伤。这些发现不仅深化了对CD20耗竭疗法作用机制的理解，还为开发针对胶质细胞的MS治疗策略提供了新的思路。未来的研究需要进一步验证这些发现在临床中的应用价值，并探索其与现有治疗方法的协同效应。