光控蛋白质共价结合与切割：新型光开关内含肽（PS Intein）的开发与应用

为解决哺乳动物细胞中蛋白质共价结合与切割的精确光控难题，研究人员开发了基于双VVD光感受器和gp41-1内含肽的光开关内含肽（PS Intein）。该系统具备低暗背景、高效率和无需外源色素等优势，成功实现了光诱导的蛋白质连接、切割及转录激活器释放，为细胞命运调控和精准靶向治疗提供了强大工具。

　　

在生命科学领域，精确控制细胞内蛋白质的共价结合与切割对于调控细胞过程和信号通路至关重要。然而，现有的光遗传学工具（optogenetic tools, OTs）在哺乳动物细胞应用中面临诸多挑战：暗背景活性高、稳定性差、效率低下，或需要外源添加非天然氨基酸。这些限制严重阻碍了它们在生物医学研究中的广泛应用。

为了突破这些技术瓶颈，来自美国阿尔伯特·爱因斯坦医学院的研究团队Mikhail Baloban、Kyrylo Yu. Manoilov等人在《Nature Communications》上发表了最新研究成果。他们成功开发出一种新型光开关内含肽（Photoswitchable Intein, PS Intein），通过将串联Vivid（VVD）光感受器嵌入gp41-1迷你内含肽，实现了高效、低背景的光控蛋白质剪接。该系统不仅能够精确调控蛋白质的共价连接和切割，还可用于光诱导的基因表达和细胞凋亡，为合成生物学和细胞治疗提供了全新工具。

研究团队采用多项关键技术方法：首先通过分子设计将双VVD结构域插入gp41-1内含肽特定位点，构建光控变体；利用流式细胞术系统评估不同构建体的光暗对比度；采用Western blot验证蛋白质剪接效率；通过细胞活力检测和 caspase-3 活性报告系统评估光诱导凋亡效果；使用荧光显微镜观察亚细胞定位和基因表达空间模式；最后通过启动子特异性表达实验验证细胞靶向能力。所有实验均在HeLa、HEK293T和MDA-MB-231等细胞系中完成，部分实验通过腺相关病毒（AAV）递送系统验证。

Engineering of photoswitchable intein

研究人员首先选择尺寸最小（125个氨基酸）、速度最快的gp41-1内含肽作为工程化基础。通过在其特定位点插入包含两个VVD光感受器结构域的LightR环，构建了光控内含肽原型。经过系统优化连接子长度和插入位点，最终获得最佳变体PS Intein，其光暗对比度达到12.1倍。

Characterization of PS Intein

与组成型活性的gp41-1阳性对照和催化失活（C1A突变）阴性对照相比，PS Intein显示出可忽略的暗背景活性，与阴性对照相当。Western blot分析证实光照后mCherry蛋白的成功重建。光照时间测试表明，仅5分钟照射即可产生25%的信号增加，2小时达到平台期。

Split PS Intein benchmarking and application to protein ligation

将PS Intein在天然拆分位点分割为Int^N和Int^C两部分，仍保持9倍的光暗对比度。与基于AsLOV2的LOVInC系统相比，PS Intein显示出显著更低的暗背景和更高激活效率。通过将TetR和vp16分别融合到Split PS Intein的两部分，证实两个片段在黑暗中不发生相互作用，只有在光照后才通过蛋白质剪接形成有功能的tTA转录激活复合物。

Light-induced protein cleavage: apoptosis via Bid activation

研究人员设计PS Intein Bid系统，将Bid蛋白的N端和C端结构域分别放置在Int^N两侧。光照诱导Bid切割，释放C端BH3结构域，激活caspase-3通路引发凋亡。细胞活力实验显示，30分钟光照导致20%细胞死亡，6小时光照达53%。Caspase-3抑制剂Z-VAD-FMK可有效阻断这一过程。

Light-induced protein release: activation of gene expression

通过将转录激活因子（tTA或Gal4-vp16）与内质网定位结构域（ER^T2）融合，并利用PS Intein介导的光控切割，实现细胞质到细胞核的蛋白释放。环状排列版本（cp PS Intein）使用两个ER^T2结构域，显示出590倍的光暗对比度，显著高于单ER^T2设计。该系统在多种细胞系和稳定表达细胞中均保持高效性，甚至秒级光照即可激活基因表达。

Specific cell targeting with light-induced gene expression

研究人员将cp PS Intein tTA系统置于癌症特异性启动子（如hTERT、BIRC5）控制下，实现光控的细胞特异性靶向。更进一步，利用Split PS Intein系统将Int^N和Int^C分别由不同组织特异性启动子控制，实现了基于光控和转录逻辑门的多重靶向策略。

本研究开发的PS Intein技术平台代表了光控蛋白质操作领域的重大进展。其核心优势在于将高效、低背景的光控特性与内含肽介导的共价键形成能力相结合，克服了现有工具的多个局限性。通过巧妙的分子设计，研究人员证明了该系统在多种应用场景中的实用性：从基础的蛋白质连接和切割，到复杂的基因表达调控和细胞命运决定。

特别值得关注的是，PS Intein系统展示出的高光暗对比度（最高达590倍）和快速响应特性（秒级激活），使其特别适合动态生物学过程的研究。其能够稳定整合到基因组中并在多种细胞类型中工作的特性，为长期细胞工程和基因治疗应用提供了可能。

此外，该技术的模块化设计允许灵活适配各种蛋白质操作需求，包括多逻辑门集成和细胞特异性靶向。这种灵活性结合光控的时空精确性，为合成生物学、细胞治疗和精准医学提供了强大工具。例如，在癌症治疗中，可通过肿瘤微环境特异性启动子和光控双重靶向策略，实现更高特异性的治疗干预。

PS Intein技术的成功开发不仅解决了现有光遗传学工具在哺乳动物细胞应用中的关键限制，更为研究人员提供了探索细胞过程、设计合成生物学回路和开发新型治疗策略的强大平台。随着进一步优化和应用拓展，这项技术有望在基础研究和临床应用中发挥重要作用。