基于荧光寿命光子计数的高时空分辨率技术实现神经元快慢信号的绝对测量

为解决传统荧光强度测量无法提供绝对量化及慢速信号检测的难题，研究人员开发了高频荧光寿命光子计数技术（FLIPR），通过频域模拟处理实现ps级精度、kHz级速度的荧光寿命测量。该技术结合新型多巴胺传感器dLight3.8，首次在自由活动小鼠中同步检测到纹状体不同亚区的强直性和相位性多巴胺信号，揭示了奖赏与厌恶刺激下多巴胺信号的时空差异性调控，为神经调制研究提供了革命性工具。

　　

神经科学领域长期面临着一个关键技术挑战：如何对活体大脑中快速变化的神经信号和缓慢持续的化学信号进行同步、精确的定量检测。传统荧光成像技术主要依赖荧光强度变化进行相对测量，但受到传感器表达量差异、光漂白效应、血流伪迹和动物运动干扰等因素限制，难以提供绝对定量数据，更无法同时捕捉从毫秒级到小时级的多时间尺度动态过程。

为了解决这一难题，哈佛医学院Bernardo L. Sabatini团队在《Neuron》发表了突破性研究成果。研究人员开发了一种名为高频分辨率荧光寿命光子计数（FLIPR）的新型光学测量技术，结合新开发的基因编码多巴胺传感器dLight3.8，首次实现了在自由活动小鼠中对多巴胺信号的绝对定量测量，揭示了纹状体不同功能亚区在奖赏和厌恶刺激下呈现截然不同的多巴胺动态特征。

研究团队运用了多项关键技术：自主搭建的频域荧光寿命测量系统（FLIPR）通过模拟相位检测实现ps级精度寿命测量；开发dLight3.8多巴胺传感器的寿命响应突变体（dLight3.8^mut）作为对照；采用光纤光度记录技术对自由活动小鼠进行长期监测；结合光遗传学操控验证信号特异性；通过脑片荧光寿命显微成像（FLIM）进行离体验证。

FLIPR系统设计与验证

研究人员对传统频域测量系统进行了关键改进：选用高压缩点频率混频器减少强度依赖性误差，采用物理延迟线优化相位偏移平衡，通过偏置T型接头和衰减器消除电子反射伪迹。体外测试表明，FLIPR在0.5-14 MHz光子计数范围内保持稳定测量，而传统时间相关单光子计数（TCSPC）方法在高于1 MHz时因光子堆积效应出现寿命低估。该系统可实现10-1000 Hz采样率下的ps级方差测量，成本较传统系统降低约44%。

体内稳定性和长期记录能力

表达蛋白激A荧光寿命传感器（FLiM-AKAR T391A）的小鼠显示，荧光寿命在2小时记录期间变异系数仅为0.35%，显著低于强度信号的7.75%变异。不同绿色荧光蛋白变体（GFPivy、sfGFP、FLiM-AKAR T391A、GFP-BRuSLEE）在体内表现出显著差异的寿命值（0.678-2.898 ns），且phasor分析均落在通用半圆上，证实单指数衰减特性。

dLight3.8作为多巴胺寿命报告分子

表达dLight3.8的伏隔核核心区（NAC）记录显示，寿命与强度信号高度相关。光遗传激活中脑多巴胺神经元引起寿命增加，抑制则降低寿命。D1受体拮抗剂SCH23390（10 mg/kg）显著降低dLight3.8基线寿命和方差，而结合位点突变体dLight3.8^mut（D127A）则表现出显著降低的基线波动，证实信号特异性。

相位性和强直性多巴胺信号的区域差异

在纹状体尾侧（TOS）和NAC同步记录发现：食物奖赏引起NAC和TOS均出现相位性多巴胺升高，NAC响应幅度约为TOS的2倍；足底电击在TOS引发大型相位性瞬变后伴随小幅下降，而NAC几乎无响应。高频采样（20 Hz）准确捕获瞬变幅度，1 Hz采样严重低估峰值变化。

强直性多巴胺的基础水平与动态调节

TOS区基础多巴胺水平显著高于NAC，该差异在扣除自体荧光贡献后仍然存在，且dLight3.8^mut组无区域差异。在电击刺激期间，NAC强直性多巴胺持续降低，结束后迅速恢复；TOS强直性水平在电击后持续升高约5分钟。双色FLIPR系统成功同步记录多巴胺和钙信号（jRCaMP1b），展示多模态测量能力。

该研究建立了荧光寿命光子计数技术体系，解决了神经科学中长期存在的绝对定量测量难题。FLIPR系统具备低成本、高稳定性、易推广等优势，可兼容现有光纤记录平台。研究发现揭示了纹状体功能亚区在多巴胺信号处理中的分工机制：NAC主要编码奖赏相关相位信号，而TOS对威胁刺激表现出强响应性，且两区强直性水平受到行为状态的差异化调节。这些发现为理解多巴胺系统在学习记忆、精神疾病中的机制提供了新视角，技术平台为未来开发更多寿命编码传感器奠定了基础。研究推动神经化学测量从相对定量向绝对定量范式转变，有望在帕金森病、成瘾、精神分裂症等疾病模型中实现更精准的神经调制监测。