糖原合酶激酶3（GSK3）是调节性T细胞发育与功能的核心调控因子，揭示自身免疫与肿瘤免疫新机制

本研究发现糖原合酶激酶3（GSK3）是调节性T细胞（Treg）发育和功能维持的关键激酶。缺失GSK3会引发致命性自身免疫，导致β-连环蛋白（β-catenin）异常积累和代谢重编程，并显著增强抗肿瘤免疫反应。该研究为靶向GSK3增强肿瘤免疫治疗提供了理论依据。

　　

引言

调节性T细胞（Regulatory T cells, T_reg）是一类表达转录因子FOXP3的CD4⁺T细胞亚群，在维持免疫耐受及抑制过度免疫反应中发挥关键作用。然而，其在肿瘤微环境中也可能抑制抗肿瘤免疫应答。T_reg的发育、稳态及功能受到多种信号通路的精密调控，其中PI3K-Akt-mTOR信号轴尤为关键。该通路下游的一个重要节点是糖原合酶激酶3（Glycogen Synthase Kinase-3, GSK3），它是一种可被Akt磷酸化并抑制的丝氨酸/苏氨酸激酶，拥有GSK3α和GSK3β两个高度同源的亚型。GSK3参与多种细胞过程，其最著名的功能之一是作为β-连环蛋白（β-catenin）降解复合体的核心组分，调控Wnt信号通路。尽管在效应T细胞中，GSK3的活性已被证明影响其分化和功能，但其在T_reg中的特异性作用，尤其是在体内环境下的功能，此前尚不明确。

缺失Gsk3a/b导致致命性自身免疫性疾病

为探究GSK3在T_reg中的特异性功能，研究者构建了T_reg特异性条件性敲除双 paralog 的小鼠模型（Foxp3^YFP-Cre × Gsk3a^LoxP × Gsk3b^LoxP，以下简称Gsk3a/b^ΔTreg）。出乎意料的是，这些小鼠在出生后约3周便因严重的多系统炎症性疾病而死亡，病症累及皮肤、肺和肝脏。小鼠生长迟缓，出现皮炎，肝肺组织中有密集的炎症细胞浸润，并伴有淋巴结和脾脏肿大。血清细胞因子分析显示，干扰素-γ（IFN-γ）、肿瘤坏死因子（TNF）、MCP-1、白细胞介素-6（IL-6）和IL-23水平显著升高。流式细胞术分析发现，脾脏、肠系膜淋巴结（MLN）和肺中积累了活化的（CD44^hiCD62L^lo）常规T细胞，这些细胞在刺激后能产生IFN-γ、TNF，在肺中还能产生IL-17A。此外，小鼠还表现出体液自身免疫的特征，血清中总IgM、IgG1、IgG2a、IgG2b水平以及IgG2a和IgG2b型的抗双链DNA（dsDNA）自身抗体均增加，同时伴随生发中心（GC）B细胞和滤泡辅助性T细胞（T_FH）数量的增多。这些结果表明，在T_reg中缺失GSK3会引发严重的自发自身免疫，涉及Th1、Th17和体液免疫反应。

GSK3是T_reg发育和稳态所必需的

对3周龄Gsk3a/b^ΔTreg小鼠的T_reg群体进行分析发现，除腹股沟淋巴结外，淋巴组织和胸腺中的T_reg数量急剧减少。存活的T_reg表现出功能失调：它们产生高水平的IFN-γ和TNF，并高表达控制Th1和Th17程序的转录因子T-BET和ROR-γt。与抑制功能相关的表面分子，如CTLA-4、神经纤毛蛋白-1（NRP-1）、CD73和CD25的表达均下降。维持T_reg身份稳定性的关键转录因子Helios和FOXP3的表达水平也降低。正如预期，由于GSK3参与其降解，β-catenin在缺失GSK3的T_reg中积累。CD25（IL-2Rα链）表达降低导致其对IL-2刺激的STAT-5磷酸化反应受损，这进一步损害了T_reg的稳定性。

对脾脏T_reg进行批量RNA测序（RNA-seq）发现，99个基因表达存在差异。其中，与效应T_reg功能和Th1极化相关的基因（如< i>Gzmb和< i>Gadd45g）上调，而与抑制功能相关的基因（如< i>Nt5e（编码CD73）、< i>Cd83、< i>Maf等）则下调。基因集富集分析（GSEA）显示，细胞杀伤通路以及氧化磷酸化（OxPhos）相关通路被激活，而核苷代谢过程相关通路被抑制。这表明，缺失GSK3不仅导致T_reg谱系不稳定和效应分子表达缺陷，还引发了显著的代谢改变。

Gsk3a/b缺失对T_reg的影响是细胞内在性的

为确认观察到的表型是细胞内在因素所致，研究者进行了体外实验和嵌合体分析。通过体外使用IL-2和TGF-β将初始CD4⁺T细胞诱导分化为T_reg（iT_reg）后发现，尽管FOXP3⁺细胞比例仅有轻微下降，但来自Gsk3a/b^ΔTreg小鼠的iT_reg在抑制野生型CD4⁺T应答细胞增殖的能力方面显著受损。其表面标志物的变化（CD73和NRP-1减少，β-catenin增加）与体内结果一致。鉴于β-catenin的积累可能有害，研究者使用CRISPR-Cas9技术在Gsk3a/b^ΔTreg iT_reg中进一步敲除了< i>Ctnnb1（编码β-catenin）。结果显示，缺失β-catenin可以挽救其抑制功能，并部分恢复ICOS、CD73和HELIOS的表达。

此外，利用Foxp3基因位于X染色体而导致的随机失活现象，研究者分析了雌性嵌合小鼠。发现YFP⁺（即Gsk3a/b缺失）的T_reg在FOXP3⁺群体中的比例和数量显著偏低，且其表面抑制性蛋白（NRP-1、CD39、CD73、CTLA-4）表达降低，而β-catenin表达升高。这些结果证实，Gsk3a/b缺失所导致的T_reg稳态缺陷在很大程度上是细胞内在性的，并由β-catenin积累所介导。

Gsk3a/b缺失重塑T_reg代谢

GSK3是代谢调控的关键节点。转录谱分析提示Gsk3a/b^ΔTreg T_reg的OxPhos和核苷代谢通路发生显著改变。流式细胞术检测发现，脾脏T_reg中电子传递链蛋白（如细胞色素c氧化酶亚基IV (COX IV) 和细胞色素c）表达上调。使用SCENITH方法（一种基于蛋白翻译速率间接评估代谢率的流式技术）进行动态代谢谱分析发现，Gsk3a/b^ΔTreg T_reg的基础蛋白合成速率更高，并且其对葡萄糖和线粒体代谢的依赖性增强，而进一步增加糖酵解的能力（糖酵解容量）下降。MitoTracker Deep Red染色显示其线粒体质量和膜电位升高。

对体外培养的iT_reg进行细胞外通量分析（Seahorse）发现，其耗氧率（OCR）和细胞外酸化率（ECAR）均显著升高。为了深入探究代谢改变，研究者进行了稳定同位素标记的液相色谱-质谱（LC-MS）代谢组学分析。结果显示，Gsk3a/b^ΔTreg iT_reg中单磷酸和双磷酸核苷酸水平显著升高，而谷胱甘肽、二羟丙酮磷酸（DHAP）、谷氨酰胺和天冬氨酸水平降低。对葡萄糖来源碳的分析发现，Gsk3a/b^ΔTreg iT_reg中甘油-3-磷酸（G3P）、ATP、ADP的¹³C标记减少，而丙氨酸和丝氨酸中的¹³C掺入增加。此外，EdU（5-乙炔基-2'-脱氧尿苷）掺入实验表明其DNA合成增加。这些发现表明，GSK3缺失导致了T_reg代谢的深刻重编程，转向了更高的氧化磷酸化和核苷酸合成，但糖酵解中间产物的流向发生了紊乱。

急性缺失Gsk3a/b导致T_reg组织特异性活化

为研究在发育完整的T_reg中急性缺失GSK3的影响，研究者构建了他莫昔芬诱导型基因敲除小鼠（Foxp3^{eGFP-Cre-ERT2} × Gsk3a^LoxP × Gsk3b^LoxP × Rosa26-CAG-LSL-tdTomato，以下简称Gsk3a/b^ΔTreg-ERT2）。在他莫昔芬给药14天后，重组效率极高（约95%的FOXP3⁺细胞同时表达tdTomato），且T_reg比例与对照组无差异。然而，确实观察到身份不稳定的“ex-T_reg”（tdTomato⁺GFP^-）细胞略有增加。

对关键功能蛋白的分析揭示了一个有趣的组织特异性现象：在脾脏T_reg中，CD25、CTLA-4、FOXP3或NRP-1的表达没有重大差异；然而，在腹股沟淋巴结的T_reg中，ICOS、IRF-4、CD39、HELIOS和β-catenin的表达均显著上调。同样，线粒体质量和膜电位的增加也主要发生在腹股沟淋巴结而非脾脏的T_reg中。这表明急性缺失GSK3诱导的T_reg活化具有明显的组织偏好性。

GSK3控制一个效应性T_reg转录程序

为了在无发育缺陷和炎症环境影响下，解析急性缺失GSK3对T_reg基因表达的精确影响，研究者对诱导敲除14天后的小鼠腹股沟淋巴结T_reg（GFP⁺tdTomato⁺）进行了单细胞RNA测序（scRNA-seq）。整合分析共定义了8个细胞簇，包括静息T_reg、早期活化/效应T_reg和胸腺来源T_reg等主要转录程序。

分析发现，Gsk3a/b^ΔTreg-ERT2 T_reg的细胞簇比例发生显著扰动，效应T_reg积累而静息T_reg减少。多分辨率变分推断模型进行的差异丰度分析进一步证实了从静息表型向活化表型的深刻转变，并出现了两个仅存在于敲除组中的独特细胞簇。反事实差分基因表达分析显示，效应簇中< i>Icos、< i>S100a6、< i>Lgmn（编码天冬酰胺内肽酶）和< i>Cdc45（DNA复制所需）等基因表达上调。通路分析表明，IFN-γ反应、IL-2-STAT5信号、IFN-α反应和糖酵解通路在敲除组的效应簇中被激活。

两个独特的敲除簇均高表达< i>Gadd45g、< i>H2-Q2以及WNT/β-catenin靶基因< i>Sp5、< i>Tcf7和< i>Axin2。然而，它们的代谢特征迥异：一个簇高表达OxPhos基因集，而另一个簇则低表达OxPhos但高表达脂肪酸代谢基因集。这些发现表明，急性缺失GSK3诱导了一个异质性的基因表达程序，不仅上调了效应基因，还催生了可能导向促炎表型的独特T_reg亚群。

删除T_reg中的Gsk3a/b可增强肿瘤杀伤并削弱抑制能力

尽管上述发现表明急性缺失GSK3能上调T_reg的效应基因，但其功能性后果——是增强还是削弱了抑制能力——仍需明确。为此，研究者在给他莫昔芬诱导后，给Gsk3a/b^ΔTreg-ERT2和对照小鼠接种了B16黑色素瘤细胞。结果显示，Gsk3a/b^ΔTreg-ERT2小鼠的肿瘤生长被 dramatically 抑制，并伴随着不受约束的抗肿瘤免疫反应：肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）中CD8⁺和CD4⁺T细胞数量大幅增加（尽管产生IFN-γ的比例无差异），而T_reg的数量则显著减少。在脾脏和腹股沟淋巴结中，产生IFN-γ的CD4⁺和CD8⁺T细胞比例也更高。

为直接验证其抑制功能受损，研究者从幼稚CD4⁺T细胞在体外诱导生成iT_reg，并在诱导过程中加入4-羟基他莫昔芬以删除GSK3。体外抑制实验证实，来自Gsk3a/b^ΔTreg-ERT2小鼠的iT_reg其抑制能力确实受损，与 constitutive 敲除模型的结果一致。因此，无论是急性还是 constitutive 缺失GSK3，都会损害T_reg的功能，从而在体内增强抗肿瘤免疫，在体外削弱其抑制常规T细胞增殖的能力。

讨论

本研究确立了GSK3在T_reg生物学中的核心地位，揭示其是T_reg发育、稳态和功能不可或缺的调节因子。Constitutive 缺失导致致命的自身免疫， associated with T_reg数量减少、功能失调和代谢紊乱，并呈现Th1样转录特征。急性缺失虽不影响T_reg存活，但引发了广泛的转录重组，导致其向活化状态转变，并产生了表达β-catenin靶基因的独特亚群。尽管这些T_reg表达某些抑制性和效应性分子，但它们实际上无法有效控制免疫反应，无论是在肿瘤模型还是在体外抑制实验中。

β-catenin的积累是介导GSK3缺失后表型的重要机制，其缺失能部分挽救T_reg功能。代谢方面，GSK3缺失导致线粒体质量、OxPhos和核苷酸合成增加，但伴随糖酵解中间产物通路的紊乱，这可能破坏了正常的细胞功能。

这些发现对肿瘤免疫治疗具有重要启示。此前研究表明，在全部T细胞中敲除GSK3或使用小分子抑制剂可增强抗肿瘤免疫力。本研究指出，削弱T_reg的抑制功能可能是其重要作用机制之一。因此，靶向GSK3有望成为增强现有免疫疗法（如免疫检查点阻断）疗效的一种新策略。

研究的局限性

本研究存在一些局限性。首先，使用的Cre介导的基因敲除发生在特定时间点（胸