突触前PLPPR3蛋白S351位点磷酸化通过PKA-BASP1通路调控突触囊泡释放的新机制

本研究聚焦于跨膜蛋白PLPPR3在突触功能中的调控机制。研究人员通过质谱分析发现PLPPR3胞内域存在26个高置信度磷酸化位点，并证实S351是PKA的特异性磷酸化位点。该磷酸化事件促进PLPPR3与突触蛋白BASP1的结合，并调控海马神经元KCl诱导的突触囊泡释放。研究揭示了PLPPR3作为突触前信号整合器的新功能，为神经递质释放的调控机制提供了重要见解。

　　

在复杂的大脑神经网络中，突触传递是神经信息处理的核心环节。突触前末端的囊泡释放过程受到精密调控，其异常与多种神经系统疾病密切相关。磷脂磷酸酶相关蛋白家族成员PLPPR3（Phospholipid-phosphatase-related protein 3）作为一种跨膜蛋白，在神经系统中高度表达，此前已知其在轴突生长、导向和丝状伪足形成中发挥重要作用，然而其在突触中的具体功能及调控机制仍属未知领域。

随着对突触可塑性研究的深入，科学家们发现蛋白质磷酸化修饰在突触功能调控中扮演关键角色。磷酸化作为一种快速、可逆的翻译后修饰，能够动态调节蛋白质的活性、相互作用和亚细胞定位。尽管已有研究表明PLPPR3可能参与突触功能，但其具体的磷酸化图谱、调控激酶以及功能后果仍然是一个待解之谜。特别是在发育过程中，PLPPR3的表达呈现动态变化，从早期发育阶段的广泛表达逐渐转变为在成熟突触中的特异性富集，这种时空表达模式暗示其可能在不同发育阶段发挥 distinct 功能。

为了解决这些科学问题，由Charité-Universit?tsmedizin Berlin的Britta J. Eickholt教授领导的研究团队开展了系统性的研究。研究人员运用多种先进的生物化学、细胞生物学和成像技术，深入探索了PLPPR3的磷酸化特征及其在突触功能中的重要作用。他们的研究成果发表在《iScience》期刊上，为理解突触前调控机制提供了新的视角。

研究团队采用的主要技术方法包括：质谱分析技术鉴定PLPPR3胞内域的磷酸化位点；PhosTag SDS-PAGE技术分析蛋白质磷酸化状态；免疫共沉淀和亲和色谱技术研究蛋白质相互作用；STED超分辨显微镜技术观察蛋白质的亚细胞定位；Synaptophysin-pHluorin活细胞成像技术监测突触囊泡释放动力学。实验使用了HEK293T细胞系、N1E-115神经母细胞瘤细胞以及原代海马神经元培养体系，并通过对Plppr3^-/-基因敲除神经元的功能研究来验证PLPPR3的生理功能。

PLPPR3胞内域高度磷酸化

研究人员首先在体外培养9天（DIV9）的原代皮层神经元中检测PLPPR3的磷酸化状态。通过λ磷酸酶处理去除磷酸基团后，观察到PLPPR3蛋白电泳迁移率发生明显改变，提示该蛋白存在磷酸化修饰。利用NetPhos3.1磷酸化预测工具，他们在PLPPR3胞内域鉴定出43个潜在磷酸化位点。为了验证这些预测，研究团队构建了多种PLPPR3变异体，包括膜定位（ICDm）和胞质定位（ICDc）版本。PhosTag SDS-PAGE分析显示，膜定位的ICDm变异体几乎完全处于磷酸化状态，而胞质定位的ICDc变异体则显示较少的磷酸化条带，表明PLPPR3的磷酸化状态受其亚细胞定位调控。

通过质谱分析，研究人员最终在PLPPR3胞内域鉴定了26个高置信度磷酸化位点。这些位点形成两个密集的磷酸化簇：一个位于氨基酸343-400区域，平均每5个氨基酸就有一个磷酸化位点；另一个位于560-575区域，平均每3个氨基酸有一个磷酸化位点。这些磷酸化簇位于酸性polyE盒的两侧，可能共同调节PLPPR3胞内域与质膜内叶的相对位置。

PKA磷酸化PLPPR3 S351并调控其与BASP1的结合

研究人员通过体外磷酸化实验发现，PKA能够磷酸化纯化的PLPPR3胞内域。基于已知的PKA识别 motif，PLPPR3胞内域存在4个潜在的PKA靶点，其中S351和T380在HEK293T细胞中被质谱鉴定为磷酸化位点，S379也在之前的蛋白质组学研究中被报道。通过药理学调控PKA活性和位点定向突变，研究团队证实S351是PKA在PLPPR3上的主要磷酸化位点。Forskolin和8-Br-cAMP处理能够诱导PLPPR3-N的磷酸化，而这种效应可被PKA抑制剂H89阻断。S351A突变体则完全丧失了PKA诱导的磷酸化能力。

磷酸化修饰通常调节蛋白质-蛋白质相互作用的性质和强度。研究人员利用亲和色谱技术，使用PLPPR3 S351磷酸化和非磷酸化肽段从成年脑组织裂解液中富集相互作用蛋白。质谱分析鉴定出BASP1（Brain Acid Soluble Protein 1）作为PLPPR3 pS351的特异性结合伴侣。免疫共沉淀实验进一步证实，PLPPR3 ICDm与BASP1在稳态条件下存在相互作用，Forskolin刺激后这种相互作用显著增强，而PLPPR3-ICDm-S351A突变体则显示结合能力降低。

内源性PLPPR3在神经元和成年脑组织中的S351磷酸化

尽管PLPPR3 S351不调控丝状伪足形成，但保守性分析表明这可能是一个功能相关位点。研究人员开发了anti-PLPPR3 pS351磷酸化位点特异性抗体，并 rigorously 验证了其特异性。实验发现，在DIV8海马神经元中，Forskolin处理能够显著增加PLPPR3 pS351水平，同时已知的PKA靶点GluA1 pS845和DARPP32 pT34也相应增加。在发育过程中，PLPPR3 pS351在DIV9神经元中最为显著，与突触发生期相吻合。急性脑切片实验表明，Forskolin刺激也能诱导成年脑组织中PLPPR3 S351的磷酸化。此外，突触体分级实验显示PLPPR3 pS351在突触体组分中富集，与已知突触标记物共定位。

PLPPR3和BASP1定位于轴突突触前簇

利用STED超分辨显微镜，研究人员在DIV16海马神经元中观察内源性PLPPR3的分布。结果显示PLPPR3以明显的点状结构沿轴突分布，与突触前标记物VGLUT1共定位。在Plppr3^-/-海马神经元中表达膜定位的PLPPR3 ICDm变异体，能够重现内源性PLPPR3在突触前终末的定位，与共转染的Synaptophysin-GFP共定位。S351A突变体也显示类似的定位模式。

研究人员同时研究了BASP1的突触定位。新开发的anti-BASP1抗体能够特异性识别约50kD的条带。STED显微镜显示，内源性BASP1在成熟DIV16海马神经元中沿轴突呈点状分布，与VGLUT1共定位。共表达BASP1-Flag和Synaptophysin1-GFP也证实它们在海马神经元轴突簇中共定位。在突触体制备中，BASP1也显著富集于突触区室。最重要的是，PLPPR3 ICDm与BASP1在Plppr3^-/-神经元轴突点状结构中共定位。最近邻分析显示，BASP1和PLPPR3与突触前标记物Synaptophysin的空间关系证实了它们的突触前定位，且两者之间存在共簇集现象，最近邻峰值在～100 nm处。

PLPPR3 S351磷酸化调控突触囊泡释放

PLPPR3在发育过程中从轴突 shaft 和丝状伪足的弥散或点状标记向VGLUT1和Synaptophysin标记的轴突 bouton 的定位转变，以及其在成年脑突触体中的定位，都提示其可能参与突触传递功能。研究人员使用Synaptophysin-pHluorin（Syph-pHluorin）探针来研究SV释放动力学。该探针由对pH敏感的荧光蛋白标记Synaptophysin的腔内面构成，当突触囊泡与质膜融合时，荧光信号因暴露于中性pH环境而增强。

实验首先在WT神经元中共表达PLPPR3 ICDm-Halo和Syph-pHluorin，活细胞成像证实PLPPR3 ICD在突触 bouton 中富集。通过比较Plppr3^-/-神经元和WT神经元的pHluorin assay，发现Plppr3^-/-神经元中KCl诱导的SV释放增加，表明内源性突触前PLPPR3对SV释放施加 tonic 抑制信号。

更重要的是，在Plppr3^-/-神经元中表达WT PLPPR3 ICDm能够将SV释放 rescue 至WT水平，而表达PLPPR3 ICDm S351A突变体则无法 rescue SV释放缺陷。这些结果表明PKA依赖的PLPPR3 S351磷酸化在神经递质释放调控中起关键作用。

研究结论与讨论表明，PLPPR3膜蛋白作为神经元突触的信号整合器，通过其突触前定位调控轴突 bouton 中的突触囊泡外排。特别重要的是，这一功能依赖于PKA靶向的PLPPR3胞内域S351位点磷酸化。PLPPR3胞内域存在两个密集的磷酸化簇，这些簇与PLPPR蛋白家族胞内域中保守区域重叠，尽管实际磷酸化位点在不同PLPPR间保守性较差。S351在PLPPR3中跨物种完全保守，但在其他PLPPR中保守性较差，表明其可能调控PLPPR3特有功能。

这些磷酸化簇与酸性polyE盒可能共同调节胞内域相对于质膜内叶的定位。磷酸化增加PLPPR3胞内域的总负电荷，可能排斥其与质膜内叶的接近，同时使其可用于与其他被高酸性残基吸引的膜蛋白或胞质蛋白相互作用。

PKA依赖的PLPPR3 S351磷酸化诱导其与BASP1相互作用。BASP1是一种酸性、 intrinsically disordered 蛋白，已知调控皮层肌动蛋白动力学和质膜磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸的可用性。多项研究表明BASP1存在于突触组分中，与突触小泡相关蛋白如VAMP2、synaptojanin-1和dynamin-1共定位和相互作用，提示其参与突触传递或突触囊泡循环。

研究发现Plppr3^-/-海马神经元显示增加的SV释放，表明内源性突触前PLPPR3对SV释放施加 tonic 抑制信号。这种 tonic 抑制信号可能源于与SV分泌机制蛋白的相互作用或KCl诱导膜去极化的失调。PKA依赖的PLPPR3 S351磷酸化可能 fine-tune 或控制PKA对突触前增强的程度。

研究还提出了GPCR调控的PLPPR3在中枢神经系统突触中的作用模式。多种神经递质如腺苷、血清素、内源性大麻素和多巴胺都通过激活与Gs或Gi/o蛋白偶联的GPCR受体来调控突触前功能，这些受体进而调节PKA活性。未来研究需要 investigate 不同神经递质系统在体内对PKA-cAMP驱动的PLPPR3 S351磷酸化的潜在调控及其与BASP1在轴突终末的相互作用。

该研究的局限性在于使用了相对强烈的通用高浓度KCl方案来触发突触前活性，这与常见生理刺激相比强度较高，提示不同模式的SV释放可能对突触前PLPPR3具有不同的依赖性。此外，PLPPR3在特定GABA能和谷氨酸能神经元亚型中的表达模式提示其调控突触囊泡释放的功能可能与大脑中特定神经元网络相关。

这项研究为理解突触前调控机制提供了重要 insights，建立了PLPPR3-PKA-BASP1信号轴在突触囊泡释放调控中的新功能，为未来研究特定神经元网络中PLPPR3功能奠定了基础。开发的PLPPR3 S351抗体也可作为探测GPCR-PLPPR3关联在中枢神经系统疾病小鼠模型中 involvement 的工具。