人源多能干细胞向滋养层干细胞分化模型的建立揭示ELF5在人类胎盘发育中的功能非必需性

本研究针对人类多能干细胞（hPSC）向功能性滋养层干细胞（TSC）分化效率低且机制不明的问题，通过比较naive和primed状态hPSC分化获得的TSC样细胞（TSCn和TSCp），结合转录组学、单细胞测序和功能实验，发现TSCn分化更直接且表达C19MC miRNA簇，而TSCp存在短暂羊膜样基因表达；进一步利用该模型证明ELF5在人类TSC自我更新和分化中非必需，挑战了小鼠模型中的认知，为人类胎盘发育研究和疾病建模提供了重要工具和见解。

　　

胎盘作为胎儿发育过程中至关重要的器官，负责氧气和营养物质的供应以及废物的清除，其功能障碍与多种妊娠疾病如先兆子痫密切相关。滋养层细胞（trophoblast）起源于囊胚的滋养外胚层（trophectoderm, TE），是最早分化的胚胎谱系，主要包括细胞滋养层细胞（cytotrophoblast, CT）、绒毛外细胞滋养层细胞（extravillous cytotrophoblast, EVT）和合体滋养层细胞（syncytiotrophoblast, SCT）。尽管从早期胎盘和囊胚中已成功分离出人类滋养层干细胞（trophoblast stem cell, TSC），但如何从人多能干细胞（human pluripotent stem cell, hPSC）高效、可靠地分化获得TSC仍是当前研究的难点。此外，物种间差异（如小鼠与人类）在关键调控因子如转录因子ELF5的功能尚不明确，限制了利用干细胞模型研究人类胎盘发育及相关疾病机制的进展。

针对这些问题，研究人员在《Stem Cell Reports》上发表了最新研究成果，通过系统比较naive和primed状态hPSC分化而来的TSC样细胞（TSCn和TSCp），并结合多组学分析和功能实验，深入探究了它们的转录特征、分化轨迹以及ELF5在人类TSC中的功能。

研究主要采用了以下关键技术方法：

1. 1.

   细胞培养与分化：利用添加BMP4的培养基诱导primed hPSC（H9胚胎干细胞系和HEL24.3诱导多能干细胞系）向TSC分化，而naive hPSC则直接分化；通过免疫细胞化学、RT-qPCR和活细胞成像评估细胞形态、标志物表达和增殖能力。

2. 2.

   多组学测序：进行批量RNA测序、单细胞RNA测序（scRNA-seq）和小RNA测序，分析基因表达、细胞异质性和C19MC miRNA簇表达；使用人类胚胎发育参考数据集（Zhao et al., 2024）进行细胞类型注释。

3. 3.

   功能验证：通过CRISPR-Cas9构建ELF5基因敲除（KO）细胞系，并利用siRNA进行基因敲降（KD），评估ELF5缺失对TSC维持、增殖和分化为EVT/SCT的影响。

4. 4.

   表观遗传分析：采用亚硫酸氢盐测序检测ELF5启动子区域甲基化状态。

研究结果

Establishment of TSC from naive and primed hPSC

通过形态学观察、标志物检测（GATA3、KRT7、TFAP2C）和分化能力验证，研究人员成功从naive和primed hPSC获得TSC样细胞（TSCn和TSCp），这些细胞可长期培养并保持正常核型，且能分化为具有典型多核形态的SCT（表达CGB和SDC1）和EVT，并分泌人绒毛膜促性腺激素（hCG）。

RNA sequencings reveal transient upregulation of amniotic genes and lack of C19MC expression in TSCp

批量RNA测序显示TSCn和TSCp与已报道的TSC（Okae et al., 2018）高度相似，但TSCp在分化早期短暂表达羊膜标志基因（如GABRP、TNC、CDH10），且缺乏C19MC miRNA簇（除部分II类C19MC miRNA）的表达，而TSCn则高表达C19MC，表明TSCp可能存在转录异常。

Single-cell sequencing shows differences in differentiation speeds

scRNA-seq揭示了分化轨迹的差异：naive hPSC（ESCn）在3天内快速过渡到TSC状态，而primed hPSC（ESCp）延迟退出多能性，先呈现羊膜样状态，再逐步获得TSC特征；最终TSCn和TSCp均主要定位於TSC簇，但TSCn富集於更具祖细胞特征的簇（高表达Wnt通路基因）。

Annotation to embryo reference reveals distinct differentiation trajectories

通过人类胚胎参考工具注释发现，TSCn分化更直接，早期即注释为TE/CTB/SCT谱系，而TSCp先注释为上皮层（epiblast）和羊膜，后期才获得滋养层注释，进一步证实了分化路径的差异。

ELF5 is dispensable in TSC maintenance and growth

尽管ELF5启动子在TSC中呈低甲基化状态，但其表达量普遍较低；通过siRNA敲降和CRISPR-Cas9敲除实验证明，ELF5缺失不影响TSC的形态、增殖（活细胞成像验证）或分化为EVT/SCT的能力，scRNA-seq也显示ELF5 KO细胞与野生型在滋养层标志物表达上无显著差异，表明ELF5在人类TSC中并非必需因子。

讨论与结论

本研究不仅建立了可重复的hPSC向TSC分化体系，还通过多组学比较揭示了naive和primed状态hPSC的分化异同：TSCn更接近真实TSC，分化直接且表达C19MC，而TSCp存在短暂异常转录状态。更重要的是，研究颠覆了小鼠模型中ELF5为TSC关键调控因子的认知，证明其在人类TSC维持和分化中非必需，提示物种间功能差异或其他ELF家族因子（如ELF3）的可能补偿作用。这些发现为利用hPSC模型研究人类胎盘发育、疾病机制（如先兆子痫）和药物筛选提供了宝贵资源，同时强调了在转化研究中需谨慎对待物种特异性分子机制。

研究的局限性包括使用的细胞遗传背景有限（仅H9和HEL24.3），且naive hPSC的重编程协议可能影响部分结果，未来需扩大样本验证。