pH梯度升高驱动mRNA-脂质纳米粒形态变化的阶段性机制及其对制剂设计的启示

本研究针对mRNA-LNP制备过程中缓冲液交换引发的形态变化机制不明确的问题，通过FRET、SAXS和cryo-EM等多技术联用，揭示了不同电离脂质（MC3/ALC-0315/SM-102）在pH升高过程中呈现阶段性形态重构的规律，发现SM-102因较高pKa值在生理pH下仍保留双层结构。该研究为优化LNP生产工艺提供了关键理论依据，对核酸药物递送系统设计具有重要指导意义。

　　

随着COVID-19 mRNA疫苗的广泛应用，脂质纳米粒（LNP）作为核酸药物的递送载体已成为生物医药领域的核心技术创新点。然而在LNP工业化生产过程中，缓冲液交换环节引发的颗粒形态变化机制始终是"黑箱"——当制备体系从酸性pH环境过渡到生理pH时，电离脂质的质子化状态改变究竟如何影响LNP内部结构重组？这种变化是瞬时发生还是存在稳定中间态？不同电离脂质的pKa差异会带来怎样的制剂特性分化？这些问题直接关系到mRNA药物的封装效率、稳定性和体内递送效果。

为了破解这一技术瓶颈，Monash大学的研究团队在《Molecular Therapy Methods & Clinical Development》发表了突破性研究。他们选取了三种经FDA批准药物使用的电离脂质：用于Onpattro的DLin-MC3-DMA（MC3）、用于Comirnaty的ALC-0315和用于Spikevax的SM-102，通过多维度技术联用揭示了pH梯度升高过程中LNP形态变化的阶段性规律。

研究团队采用荧光共振能量转移（FRET）技术监测颗粒融合动力学，通过动态光散射（DLS）分析粒径变化，借助小角X射线散射（SAXS）解析内部结构有序度，并结合冷冻电镜（cryo-EM）直接观察形态演变。关键技术方法包括：①采用微流控混合技术制备标准化LNP；②通过TNS滴定法测定电离脂质表观pKa；③建立DiO/DiI双标记FRET体系量化颗粒融合程度；④利用同步辐射SAXS分析脂质排列结构；⑤通过低温电镜捕获不同pH下的形态学特征。

Morphological changes occurring during production of MC3 LNPs

通过FRET检测发现MC3-LNP在pH 5.0-5.5区间出现阶段性融合信号增强，在565 nm波长处FRET效率提升70%。DLS数据显示Z平均粒径从pH 4.0的30-40 nm增至pH 5.25-6.50区间的70-80 nm，且多分散指数（PDI）从>0.5降至0.2以下。SAXS图谱显示在q=0.11 ?^-1处存在宽衍射峰（对应d-spacing约5-6 nm），该信号在pH 7.4时基本消失。cryo-EM图像证实pH 5.5时存在具有囊泡状凸起的部分融合颗粒。

Morphological changes occurring during production of LNPs with alternative ionizable lipids

对比研究发现ALC-0315-LNP在pH 4.75-5.00即达到最大FRET响应，而SM-102-LNP需至pH 5.25才完成融合。SAXS分析显示SM-102和DODMA制备的LNP在pH 7.4仍保留明显衍射峰，表明存在残余双层结构。四级胺脂质DOTMA-LNP的SAXS图谱在pH 5.5-7.4始终保持双衍射峰，且FRET信号在全pH范围存在。

Analysis of the structural order in LNPs from SAXS data

d-spacing分析显示分支链电离脂质（ALC-0315/SM-102）的双层间距比直链脂质短1-1.5 nm。SM-102和DODMA的d-spacing在pH 6.00-7.40区间持续增加，而DOTMA的间距值全程稳定。

研究结论表明：LNP在缓冲液交换过程中经历"初始颗粒→部分融合中间态→成熟LNP"的阶段性形态演变，关键转变pH区间仅约1个单位。电离脂质pKa值直接决定形态变化阈值——SM-102因pKa较高（6.70），在生理pH下仍有20%质子化，导致其LNP保留部分双层结构。该发现揭示了通过调整缓冲液pH策略可调控LNP最终形态，为个性化制剂设计提供了理论依据。特别值得注意的是，SM-102-LNP在内涵体酸化过程中可能更早触发膜融合机制，这为解释其高效转染现象提供了结构生物学基础。

这项研究首次系统阐明了不同电离脂质LNP的形态演化路径差异，建立的pKa-形态学-功能效能关联模型不仅对疫苗开发具有指导意义，更为下一代核酸药物递送系统的理性设计提供了关键技术参数。研究者创新的多技术联用策略也为纳米药物表征建立了新范式，推动LNP从"经验制备"向"精准设计"的跨越。