利用双染料和单染料比率型RNA传感器可视化细胞内甘氨酸动态

本研究开发了基于RNA的甘氨酸生物传感器，通过融合甘氨酸核糖开关与Broccoli类荧光适体，实现了对活体大肠杆菌内源性甘氨酸动态的高灵敏度检测。研究人员首次构建了单染料比率型传感器（SDR），利用光谱拆分技术解析Golden Broccoli与Red Broccoli的信号，克服了多染料系统的局限性，为代谢物成像提供了新工具。该研究发表于《Nucleic Acids Research》，对细菌代谢调控和疾病机制研究具有重要意义。

　　

甘氨酸作为一种重要的代谢物和细胞信号分子，在多种生物体中发挥着关键作用，例如在哺乳动物中作为神经递质影响反射、记忆和大脑发育，在植物中作为根分泌物促进与土壤细菌的共生，而在细菌中则涉及病原体毒力和孢子形成等过程。尽管其功能多样，但长期以来缺乏能够在单细胞水平可视化细胞内甘氨酸动态的工具。传统方法如液相色谱-质谱联用（LC-MS）需要裂解大量细胞且通量低，而基于甘氨酸氧化酶的电化学传感器虽适用于细胞外检测，却无法实现细胞内测量。现有的光学工具如基于核糖开关的荧光关闭传感器或FRET传感器仅适用于体外或细胞外检测，无法满足活体单细胞成像的需求。因此，开发一种能够实时、定量监测细胞内甘氨酸变化的传感器成为迫切需求。

为了突破这一技术瓶颈，研究人员设计并开发了基于RNA的荧光开启型甘氨酸生物传感器。他们通过将结构复杂的甘氨酸核糖开关与Broccoli类荧光适体融合，构建了多种传感器变体。其中，性能最优的传感器glyS及其双染料比率型版本Pepper-glyS成功应用于活体大肠杆菌中药物诱导的内源性甘氨酸积累的可视化。然而，双染料系统存在固有局限性，如染料性质差异可能导致定量误差。为解决这一问题，研究团队进一步开发了新型Golden Broccoli适体，该适体与Red Broccoli结合相同染料DFHO，但通过光谱拆分技术可实现信号分离，从而首次实现了单染料比率型传感器（SDR）的构建，并在体外和活体大肠杆菌中均验证了其甘氨酸检测能力。

本研究主要采用了以下关键技术方法：首先通过体外转录和荧光分析筛选传感器变体；利用结合亲和力测定和动力学分析表征传感器性能；通过流式细胞术和荧光显微镜进行活细胞成像；使用光谱流式细胞仪和数学拆分方法处理单染料比率信号；并在大肠杆菌和枯草芽孢杆菌中验证传感器适用性。研究队列包括大肠杆菌BL21(DE3) Star和枯草芽孢杆菌野生型1012。

研究结果部分如下：

设计并筛选甘氨酸生物传感器

通过融合甘氨酸核糖开关与荧光适体，构建了42种传感器候选物，其中7种显示甘氨酸响应。最佳设计S2-P3基于Desulfitobacterium hafniense核糖开关，其中Dh-b传感器显示5.2倍荧光开启。通过系统发育筛选，最终获得多个高活化传感器，如Ho-b、Spn-b、Spa-b、Ac-b和Sc-b。

表征甘氨酸生物传感器

传感器亲和力跨越近三个数量级（K_d从微摩尔到毫摩尔级），且对甘氨酸高度特异（对类似物响应≤1.5倍）。动力学显示半最大活化时间在几分钟内，符合RNA传感器典型特征。镁离子依赖性实验表明≥1 mM Mg²⁺为最佳功能条件，与核糖开关折叠需求一致。

活细胞中甘氨酸检测

glyS传感器在大肠杆菌中显示3.6倍荧光增强响应10 mM甘氨酸处理，且能检测内源性甘氨酸水平。时间进程实验显示20分钟内即可检测到甘氨酸积累，6小时达到平衡。通过药物半胱胺（cysteamine）处理抑制甘氨酸裂解，成功可视化内源性甘氨酸动态积累。

双染料比率型成像

Pepper-glyS传感器结合Broccoli-DFHBI-1T（绿）和Pepper-HBC620（红）实现比率检测，流式细胞术和显微镜成像均显示2.3倍G/R比率增加响应半胱胺处理。研究发现染料渗透性差异（DFHBI-1T快速平衡 vs HBC620慢速平衡）可能影响定量准确性。

拓展Broccoli适体光谱范围

通过突变碱基三联体（如M1-M5）和G-四链体连接区，开发了Golden Broccoli（GBr），其与DFHO结合显示最大蓝移（激发/发射峰差21/10 nm），且与Red Broccoli（RBr）形成最光谱分明对。结合亲和力测定显示GBr K_d~1.31 μM，与OBr相当。流式细胞术验证了DFHO在E. coli中亮度优于OBI，但OBI在革兰氏阳性菌中表现更佳。

单染料比率型传感器生成

SDR glyS传感器在体外通过 spillover 校正（DFHO: 68% RBr→FITC通道；OBI: 22% RBr→FITC, 4.2% GBr→TxRed通道）实现比率检测，RBr/GBr比率随甘氨酸增加。在活体E. coli中，通过光谱流式细胞仪和常规流式细胞仪（补偿处理）均实现1.2倍比率响应，显微镜成像结合数学拆分同样验证1.1倍比率增加。

研究结论与讨论部分强调，本研究首次开发了用于细胞内甘氨酸检测的荧光生物传感器，解决了现有工具无法实现单细胞动态可视化的难题。通过利用核糖开关的分子内互作机制，传感器表现出高灵敏度和特异性，且其亲和力范围宽泛适用于多种应用场景。双染料比率传感器Pepper-glyS成功应用于活细胞成像，但染料差异提示需谨慎实验设计。创新的单染料比率传感器SDR glyS通过光谱调谐和拆分技术，避免了多染料系统的复杂性，为活细胞代谢物成像提供了更可靠工具。尽管当前DFHO在E. coli中亮度有限，但其快速平衡特性利于近实时监测。该传感器平台可拓展至哺乳动物细胞研究，但需评估免疫原性和镁离子依赖性。总体而言，该研究不仅推动了RNA传感器技术的发展，也为细菌代谢工程、感染机制研究和临床诊断提供了强大工具。