CircCode3：基于深度学习和多组学数据融合挖掘可翻译环状RNA的创新计算框架

本研究开发了CircCode3分析流程，整合核糖体测序（Ribo-seq）和质谱（MS）数据，通过深度学习工具DeepCircm6A和DLMSC预测m6A修饰位点和终止密码子可靠性，结合IRESfinder评估内部核糖体进入位点活性，实现了可翻译环状RNA的高精度挖掘及其开放阅读框（ORF）的精准鉴定，为环状RNA编码功能研究提供了全面解决方案。

　　

在RNA研究领域，环状RNA（circular RNAs, circRNAs）作为一类特殊的共价闭合环形RNA分子，近年来受到广泛关注。与线性RNA不同，circRNA缺乏5'端帽子和3'端多聚腺苷酸尾结构，通过反向剪接（back-splicing）形成稳定环状结构。早期研究认为circRNA主要作为竞争性内源RNA（ceRNA）发挥作用，但近年研究发现其具备翻译蛋白质/多肽的潜能，这类具有翻译功能的circRNA被称为可翻译环状RNA（translatable circRNAs）。

可翻译circRNA的翻译机制不同于经典模式，主要依赖帽非依赖性翻译途径，包括N6-甲基腺嘌呤（m⁶A）介导的翻译起始和内部核糖体进入位点（IRES）驱动的翻译起始。例如在人乳头瘤病毒中，circE7通过m⁶A修饰翻译产生E7癌蛋白；在人类细胞中，Circ-ZNF609和CircTRIM1可通过IRES机制分别翻译产生250和269个氨基酸的蛋白质。这些发现表明可翻译circRNA在肿瘤发生发展中扮演重要调控角色。

然而，当前可翻译circRNA研究面临两大挑战：一是缺乏整合多组学数据的综合分析工具，现有工具如CircPro、CircCode和MstoCirc均存在功能局限；二是ORF定位准确性不足，特别是跨反向剪接位点（BSJ）的ORF鉴定困难。为解决这些问题，陕西师范大学李玉玲教授团队开发了CircCode3分析流程，研究成果发表在《Briefings in Bioinformatics》。

本研究采用多技术融合策略：首先通过Bowtie2比对工具处理Ribo-seq数据，去除线性序列和rRNA污染，利用虚拟基因组策略识别BSJ跨读序列；质谱数据采用MSGFPlus/MaxQuant搜索定制肽段数据库；创新性开发DeepCircm6A深度学习模型（结合CNN-BiLSTM架构）预测circRNA的m⁶A修饰位点；构建DLMSC模型（三层CNN结构）评估终止密码子可靠性；集成IRESfinder软件评估IRES活性；使用orfipy工具提取跨BSJ的ORF；最后通过模拟数据集（BEERS2生成线性读段，自定义脚本生成circRNA读段）进行系统性能验证。

CircCode3工作流程

基于原有CircCode框架进行功能扩展，构建了支持Ribo-seq和MS数据并行处理的集成化流程。输入数据分别进入不同处理通道：Ribo-seq数据经过线性序列过滤、rRNA去除、BSJ读段筛选；MS数据通过"junction"命令生成候选肽段序列进行数据库搜索。最终获得经实验证据支持的circRNA集合，进而识别所有跨BSJ的ORF，并利用IRESfinder、DeepCircm6A和DLMSC评估其翻译潜能。输出结果包含比对读段、检测肽段、m⁶A修饰评估、ORF定位等详细信息，并提供可视化功能。

DeepCircm6A模型构建

为评估circRNA的m⁶A修饰潜能，开发了基于深度学习的DeepCircm6A工具。模型采用双卷积神经网络（CNN）层（卷积核尺寸分别为1×12和1×6），每层后接批归一化（BatchNorm）和ReLU激活层，输出接入双向长短期记忆网络（BiLSTM），最后通过两个全连接层（FC）生成分类结果。比较三种编码模式（One-hot、NCP、EIIP）发现组合使用效果最优。五折交叉验证显示所有评估指标（准确度、特异性、召回率、精确度、F1分数、马修斯相关系数）均超过0.93，ROC曲线下面积（AUC）达0.99。在hESC、小鼠和TransCirc数据集测试准确度均大于0.9，且显著优于DeepM6ASeq工具，表明circRNA与线性RNA的m⁶A修饰模式存在差异。

DLMSC模型构建

针对终止密码子评估需求，开发了深度学习终止密码子模型（DLMSC）。模型包含三个CNN层（滤波器数量128/32/32，卷积核尺寸8/6/4），第三CNN层输出扁平化后经dropout层（比率0.5）处理，最后通过FC层输出预测结果。训练集表现优异：准确度0.9354、灵敏度0.9299、精确度0.9403、F1分数0.9351、MCC 0.8709，AUC达0.97。使用RiboCirc小鼠数据进行独立测试，准确度0.901、灵敏度0.867、精确度0.931、F1分数0.898、MCC 0.805，证明模型具有良好的跨物种适用性。

模拟数据性能评估

通过BEERS2模拟器生成线性转录本读段，从circBase数据库选择人类circRNA序列生成BSJ跨读序列，构建包含六组数据的模拟数据集。五折交叉验证表明，CircCode3在除召回率外所有指标上均优于CircCode，假阳性率显著降低（准确度0.9973 vs 0.9655，精确度0.9968 vs 0.9355），证实其在复杂测序数据中区分可翻译circRNA的高可靠性。

主要功能模块

CircCode3提供六大核心模块：Ribo模块处理Ribo-seq数据，自动执行线性序列去除、rRNA过滤、BSJ读段筛选和ORF评估；MS模块处理质谱数据，生成候选肽段数据库并进行肽段筛选；Both模块支持Ribo-seq和MS数据同步输入与整合分析；DeepCircm6A模块预测序列中腺嘌呤m⁶A修饰可能性（支持线性和环状模式）；DLMSC模块基于终止密码子评估ORF可靠性；Draw模块生成结果可视化图形。

动植物数据应用

利用人类和拟南芥数据集验证工具实用性。在人类Ribo-seq数据集PRJNA275386中鉴定295个可翻译circRNA；MS数据集PXD041316中发现2993个可翻译circRNA。拟南芥Ribo-seq数据集PRJNA594648识别610个可翻译circRNA；MS数据集PXD022880鉴定2643个。交叉验证发现16个人类circRNA和44个拟南芥circRNA在两种数据类型中均被检测到。使用CSCD数据库人类正常染色体X circRNA数据验证，在PRJNA275386数据集中识别816个circRNA，其中204个在对应MS数据中得到验证。

研究结论表明，CircCode3通过整合直接（Ribo-seq、MS）和间接（m⁶A修饰、IRES活性、终止密码子评估）证据，显著提高了可翻译circRNA鉴定的准确性和可靠性。工具采用模块化设计，支持用户根据研究需求灵活选择分析模块，为circRNA编码功能研究提供了全面解决方案。

讨论部分指出，尽管可翻译circRNA研究取得重要进展，当前高通量测序技术仍存在局限性：一是证据类型覆盖范围较TransCirc等综合数据库有限；二是缺乏有效消除Ribo-seq和MS数据噪声的量化方法。这些挑战亟待解决以提升可翻译circRNA发现的准确性。CircCode3的推出为研究人员提供了针对特定数据集进行定制化分析的能力，弥补了数据库固定数据集的局限性，特别在跨物种分析和机制研究方面展现强大应用潜力。

该研究得到国家自然科学基金（32370297、32200236、31770333）和陕西省自然科学基金（2023-JC-YB-161、2022JQ-218）资助。CircCode3以GPL许可证开源，代码托管于GitHub平台（https://github.com/Lilab-SNNU/CircCode3），配套详细说明文档指导安装配置和基础使用。