热冷胁迫下甘蓝型油菜多倍体转录本异构体与选择性剪接的动态调控及亚基因组偏好性研究

本研究针对多倍体植物在非生物胁迫下转录本异构体多样性调控机制不清的问题，利用单分子长读长测序技术（Iso-Seq）对甘蓝型油菜（Brassica napus）热胁迫（35℃）和冷胁迫（4℃）下的转录本进行全局分析。研究发现冷胁迫减少基因异构体数量，热胁迫则增加异构体数量及选择性剪接（AS）事件，且CT亚基因组较AT亚基因组产生更多异构体。研究揭示了温度胁迫通过调控AS影响多倍体转录组可塑性，为作物抗逆育种提供新视角。成果发表于《Annals of Botany》。

　　

多倍化（polyploidy）作为植物进化的重要驱动力，通过全基因组复制（WGD）事件促使基因功能分化与新性状演化。甘蓝型油菜（Brassica napus）作为异源四倍体作物，由白菜（B. rapa, AA）和甘蓝（B. oleracea, CC）杂交形成，其A_T和C_T亚基因组间的同源基因（homeologs）表达调控机制复杂。选择性剪接（Alternative Splicing, AS）是增强转录组与蛋白质组多样性的关键机制，可产生多种mRNA异构体（isoforms），但在多倍体应对温度胁迫中的作用尚不明确。以往研究多基于短读长测序，异构体重建准确性受限，难以解析胁迫下亚基因组间AS动态及异构体组成变化。

为揭示温度胁迫对多倍体转录本异构体多样性的影响，Ryan E. Bailey与Keith L. Adams团队利用PacBio单分子长读长测序（Iso-Seq）技术，对热胁迫（35℃）和冷胁迫（4℃）处理下的甘蓝型油菜幼苗叶片进行全局转录本分析。研究通过比对参考基因组、鉴定异构体结构、预测无义介导的衰变（Nonsense-Mediated Decay, NMD）靶标及分析同源基因对，系统解析了胁迫下AS事件类型、异构体数量变化及亚基因组偏好性。结果表明，冷胁迫降低基因异构体数量，热胁迫则增加异构体数量及AS事件频率，且C_T亚基因组较A_T亚基因组产生更多异构体。研究还发现热胁迫显著增加NMD靶标异构体比例，表明AS-NMD可能参与胁迫响应调控。该研究为理解多倍体转录组可塑性及作物抗逆机制提供了新见解，成果发表于《Annals of Botany》。

研究采用以下关键技术方法：

1. 1.

   使用PacBio Sequel平台进行Iso-Seq测序，获取全长转录本序列；

2. 2.

   利用minimap2将 reads映射至甘蓝型油菜参考基因组（Chalhoub et al. 2014）；

3. 3.

   通过SQANTI2和SUPPA2流程注释异构体结构、分类AS事件（包括内含子保留IR、外显子跳跃ES等）；

4. 4.

   基于8,744对同源基因对分析亚基因组间异构体数量差异；

5. 5.

   采用RT-PCR验证特定基因的胁迫响应异构体；

6. 6.

   使用topGO进行基因本体（GO）富集分析，挖掘功能偏好性。

甘蓝型油菜异构体测序与比对

研究共获得300万条全长非嵌合 reads，映射准确率超99.9%。共鉴定约3.2万个基因，其中31,953个基因在三组条件（对照、冷、热）中共同表达。平均异构体长度在1.6-1.7 kb之间，热胁迫下平均每个基因产生3.47个异构体，显著高于对照（3.06）和冷处理（3.02）。

异构体表征揭示新剪接位点

通过比对参考基因组注释，发现37-39%的异构体包含至少一个新剪接位点（NNC类别），表明Iso-Seq技术显著拓展了已知转录本多样性。

胁迫响应性异构体数量变化呈现不对称分布

冷胁迫导致异构体数量减少（log₂比值左偏），21%基因异构体数量显著降低；热胁迫则增加异构体数量（log₂比值右偏），11.25%基因异构体数量增加。GO分析显示，冷胁迫下异构体增加的基因富集于“ABA响应”通路，而减少的基因多定位叶绿体；热胁迫下增加基因富集于“未折叠蛋白结合”功能。

热胁迫特异性促进AS事件

热胁迫下AS事件总数显著增加（P=0.02），但事件类型分布保守，内含子保留（IR）占比最高（46-49%）。冷胁迫未引起AS事件数量显著变化。

同源基因对显示C_T亚基因组异构体优势

Across all conditions, C_T亚基因组同源基因较A_T亚基因组产生更多异构体（log₂比值左偏，P<0.05）。约22%同源对表现为C_T>A_T，仅21%为A_T>C_T。热胁迫显著扰动同源对异构体分布（P=0.013），但未改变亚基因组间总体趋势。

胁迫引起同源对异构体组成动态转换

50.5%（冷）和48.5%（热）的同源对发生异构体数量分类变化（如C_T>A_T转为A_T=C_T）。功能富集显示，维持均衡分布（A_T=C_T）的基因多参与“mRNA结合”，而类别转换基因功能保守性较低。

热胁迫增加NMD靶标预测

热胁迫下可能被NMD降解的异构体（含提前终止密码子PTC）比例显著升高（P=4.6×10^?7），冷胁迫无此现象。亚基因组间NMD靶标比例无差异。

讨论与结论

本研究通过长读长测序揭示了温度胁迫对多倍体转录本异构体组成的 opposing effects：冷胁迫简化异构体 repertoire，热胁迫则通过增加AS事件拓展异构体多样性。C_T亚基因组在异构体产生中占优势，且胁迫下同源对异构体分布高度动态，表明多倍体通过亚基因组间AS分化增强转录组可塑性。热胁迫诱导的NMD靶标增加提示AS-NMD可能作为调控机制降解异常转录本，维持蛋白质组稳态。

研究结果强调了AS在 polyploid 胁迫响应中的独立于基因表达水平的调控作用，为作物抗逆遗传改良提供了新靶点（如ABA通路基因和剪接因子）。未来需结合亚细胞定位、蛋白质组学及二倍体祖先比较，进一步解析AS介导的多倍体环境适应机制。