利用Boechera微卫星网站解析十字花科Boechera属分类复杂性——以稀有三倍体B. bodiensis为例

本研究针对Boechera属中因无融合生殖和杂交导致的分类学难题，通过Boechera微卫星网站（BMW）平台整合微卫星DNA数据和形态学分析，明确了稀有三倍体B. bodiensis的基因组构成（源于B. cobrensis、B. fernaldiana和B. sparsiflora）、繁殖方式（二倍体无融合生殖）和地理分布（主要限于加州Mono县），为厘清物种边界、支持保护评估和揭示网状进化提供了关键案例。

　　

在植物分类学中，某些类群因复杂的进化历史而成为研究者面临的棘手难题。十字花科Boechera属（岩芥属）便是这样一个典型代表。该属包含约75个有性二倍体类群和超过355个遗传上 distinct 的无融合生殖杂交谱系，其中许多通过无融合生殖（apomixis）进行繁殖。这种复杂的繁殖格局带来了巨大的分类学挑战，类似于蒲公英属（Taraxacum）、山柳菊属（Hieracium）、早熟禾属（Poa）和悬钩子属（Rubus）等属中遇到的情况。无融合生殖——即不经受精形成种子的繁殖策略——在被子植物中虽罕见却具有重要的进化意义。它最常见于杂交和多倍化现象普遍的类群中。一旦建立，无性种子生产可以通过与有性近缘种的后续杂交事件传播，从而形成动态的、遗传和形态多样的杂交谱系复合体。与认为无融合生殖是进化死胡同的观点相反，许多无融合生殖类群表现出广泛的生态适应性和地理分布范围，表明无融合生殖可以促进生态位扩张和物种形成。在此背景下，Boechera属成为研究无融合生殖的进化与分类学后果的模式系统。

Boechera是北美分类学上最具挑战性的属之一，其复杂性可与其他 notoriously difficult 的类群相媲美。根据目前的界定，该属包括约75个有性二倍体类群，它们产生了约355个遗传上 distinct 的无融合生殖杂交谱系。这些杂交种包括约85个无融合生殖二倍体（在被子植物中是一种不寻常的现象）以及约265个无融合生殖三倍体（其中大多数包含三个 divergent 的基因组），还有少量无融合生殖四倍体。这些谱系中只有不到40%被命名，并且许多已发表的名称被应用得过于宽泛。尽管存在 substantial 的形态多样性，但由于涉及属内几乎所有有性二倍体的 rampant 网状进化，Boechera属内的变异通常呈现连续分布。

Boechera的进化复杂性随着微卫星DNA标记的发展和分类学上 comprehensive 数据库的建立而变得日益 tractable。这些资源被整合到Boechera微卫星网站（BMW; https://windhamlab.biology.duke.edu/），这是一个公开可访问且持续维护的平台，支持广泛的研究活动。BMW能够推断倍性和繁殖模式，识别可能的杂交种，估计亲本谱系间的遗传 divergence，并重建无融合生殖杂交种产生的复杂进化途径。它还有助于将遗传上一致的聚类界定为操作分类单元（OTUs），支持跨形态、地理和生态维度的整合分析。此外，BMW允许研究者评估OTU内的遗传多样性，并确定这种变异是源于单个杂交谱系的多样化还是多次杂交起源。通过将OTU与微卫星鉴定的模式标本联系起来，BMW也有助于解决命名法问题，从而为未来Boechera属的杂交和分类学研究奠定更坚实的基础。

本文利用BMW提供的工具和信息，探讨了Bodie Hills岩芥（Boechera bodiensis）的分类学界定、进化起源、地理分布和相对丰度。这种植物最早于1945年被采集，并于1982年被Rollins作为Arabis bodiensis发表。该分类群在标本馆中稀少，长期被认为是《濒危物种法案》保护的候选物种。然而，由于其与其他“Arabis”（Boechera）类群形态相似，其分类学身份一直不确定。

本研究旨在澄清B. bodiensis的物种边界，并促进制定适当的保护策略。研究人员利用BMW和补充数据集解决了以下问题：(1) 该分类群的倍性是多少？它是有性的还是无融合生殖的？(2) 它是通过 divergent 进化还是杂交产生的？如果是杂交种，它的亲本是什么？(3) 它在形态上与其他已描述的类群是否可以区分？其地理范围是什么？(4) 是否有理由继续将其视为可能值得《濒危物种法案》保护的稀有物种？

为了回答这些问题，研究人员开展了一项综合性的研究。关键技术方法包括：从标本馆标本或温室种植植物中提取基因组DNA；使用15个已发表的微卫星位点进行基因分型，通过多重PCR扩增和毛细管电泳分析等位变异；利用BMW平台的TESLA（基于位点和等位基因相似性的分类单元查询）和PRIUS（利用减法的亲本关系识别）算法进行数据分析，以推断基因组构成和亲本；进行花粉形态学分析以确定繁殖方式；对经过遗传验证的标本进行详细的形态学比较；并利用地理信息系统（QGIS）对所有采集地点进行地理参考和分布制图。

研究结果如下：

Boechera bodiensis是三倍体并通过无融合生殖繁殖

从B. bodiensis holotype（提取号FW504）提取的基因组DNA质量很高，为15个扩增位点提供了明确的数据。该样本在13个被认为可靠估计此参数的位点均为杂合。其中8个位点（以c8、BF3、BF15和b9为例）表现出三个等位基因，提供了强有力的证据表明B. bodiensis的 holotype 包含三个 distinct 的基因组。花粉分析提供了支持该假设的关键经验证据。与细胞遗传学确认的有性二倍体（B. sparsiflora, B. fernaldiana, B. cobrensis）和已知的无融合生殖二倍体（B. sparsiflora × sparsiflora）及三倍体（B. falcifructa）进行比较后，发现B. bodiensis的花粉与已知三倍体B. falcifructa在大小和形态上具有惊人的相似性，这提供了额外的证据表明B. bodiensis是一个无融合生殖三倍体。

Boechera bodiensis是深度分化谱系间的种间杂交种

holotype 在15个微卫星位点上的平均杂合度为0.93，远高于有性二倍体Boechera的平均水平（约0.25）。这种极高的杂合度是古老杂交事件的特征，该事件将三个高度分化的二倍体基因组结合在一起。TESLA和PRIUS分析均强烈表明，这三个基因组来源于B. cobrensis, B. fernaldiana 和 B. sparsiflora。

Boechera bodiensis包含可追溯至B. cobrensis、B. fernaldiana和B. sparsiflora的基因组

TESLA分析使用FW504作为查询样本，限于已知或推断的二倍体类群（即潜在祖先谱系或PPLs），结果表明数据库中相似性最高的标本（BOD46；AS=0.8）是距B. bodiensis模式产地仅6公里采集的一株B. sparsiflora。另外12份B. sparsiflora样本的AS值在0.73至0.6之间，使其成为最可能的PPL。数据库中下一个最相似的分类群是B. cobrensis，有26份样本的AS值在0.73至0.6之间。B. fernaldiana由两份AS值为0.73和0.62的样本代表，成为BMW中第三相似的有性二倍体。一个先前未被识别的B. cobrensis和B. fernaldiana之间的无融合生殖二倍体杂交种完成了最可能PPLs的列表，其中一份样本显示AS=0.69。PRIUS分析的结果与TESLA算法生成的结果密切平行。累积分数最高（2.0667至2.0000）的18个假设亲本组合均将B. cobrensis、B. fernaldiana和B. sparsiflora确定为推定亲本。对微卫星峰图的逐个位点检查也支持了这一假设。

Boechera bodiensis的无融合生殖二倍体亲本可能是B. cobrensis × fernaldiana

像B. bodiensis这样的三基因组杂交种不能通过单次杂交事件产生；它必须通过两次 sequential 杂交来组装。第一步涉及两个基因组 distinct 的有性二倍体杂交，形成一个能够产生未减数配子的二倍体杂交种（桥接分类群）。第二步包括该桥接分类群与第三个 divergent 的有性二倍体之间的异交事件，从而导致三基因组三倍体杂交种的形成。对于任何三个基因组的组合，有三种不同的途径可以导致三倍体终产物。就B. bodiensis的起源而言，有三种可能的桥接分类群：1) B. cobrensis × sparsiflora, 2) B. fernaldiana × sparsiflora, 和 3) B. cobrensis × fernaldiana。前两种在BMW的5000多份微卫星样本中未遇到，尽管在西部大盆地进行了广泛采样。相比之下，第三种潜在的桥接分类群B. cobrensis × fernaldiana，在本研究采样先前被鉴定为B. bodiensis的标本时被发现。这个未命名的分类群目前已知来自三个种群，都生长在距B. bodiensis 10公里范围内，并且它是我们TESLA分析识别的潜在亲本谱系中唯一的无融合生殖二倍体。

Boechera bodiensis包含多个、零星分布的种群

额外的TESLA搜索涵盖了BMW中的3000多个多倍体，用于界定B. bodiensis。分析显示，B. bodiensis的 holotype 是数据库中32个具有此推断亲本关系的三倍体之一。其中一份（存放在DS的 isotype；提取号BOD59）与 holotype 仅略有不同，表现出AS=0.95。其余30份样本的AS分数分布是不连续的，形成两个大小相等的 discrete 集群。一组与 holotype 和 isotype 共享高比例的等位基因（AS=0.87-0.77）；另一组表现出较低的AS分数（0.59-0.55），在七个位点上具有另一套亲本等位基因。另外38份BMW中的三倍体样本的AS值在0.68至0.5之间，其中35份与B. bodiensis中存在三个基因组中的两个共享。这些代表了三个先前未被识别的谱系，TESLA和PRIUS分析将其鉴定为：B. cobrensis × fernaldiana × fernaldiana (30份), B. cobrensis × fernaldiana × pendulocarpa (3份), 和 B. cobrensis × evadens × fernaldiana (2份)。将这32份三倍体样本确定为B. bodiensis，代表了23个空间 localized 的集群，在此被视为种群。其中18个经微卫星验证的B. bodiensis种群发现于加州Mono县。Mineral Co., NV确认了三个地点，邻近的Esmeralda Co., NV也确认了两个。所有四个顶级PPLs（表2中的绿色行）也都在此区域内被发现。

Boechera bodiensis具有遗传多样性，有证据表明存在多次杂交起源和杂交后突变

接受微卫星分析的32株B. bodiensis植物表现出 substantial 的变异，在15个位点数据集中检测到31种多位点基因型。从Klondike Canyon, CA采集的两个个体（分别是Honer 679存放在RSA和BLMBI的副本；附录1）彼此相同；其他30份是独特的（与所有其他至少有一个等位基因不同）。如前所述，B. bodiensis的样本形成两个集群，每个集群内部表现出相对较高的AS分数（1.0-0.77），而集群之间的分数较低（0.66-0.55）。尽管分析表明两组都包含来自B. cobrensis、B. fernaldiana和B. sparsiflora的基因组，但它们在七个位点上显示不同的亲本等位基因集合。观察到的 divergence 水平以及连接集群的残余基因型的缺乏，强烈暗示了独立的杂交起源，这在无融合生殖三倍体杂交种中是非常普遍的现象。相比之下，每个集群内的基因型多样性似乎主要是通过各种杂交后事件（包括等位基因沉默、de novo 突变和 occasional 重组）产生的。

Boechera bodiensis的形态特征与其假设的杂交起源一致

如上所述，Boechera bodiensis holotype（以及可归因于此分类群的所有其他采样基因型）起源的最可能进化途径涉及有性二倍体B. sparsiflora和无融合生殖二倍体B. cobrensis × fernaldiana之间的杂交。研究突出了B. bodiensis在这些PPLs之间的一般形态 intermediacy，并确定了将其与B. sparsiflora和B. cobrensis × fernaldiana区分开来的最有用的特征。这三个分类群可以通过其毛状体 readily 区分，毛状体始终存在，但在花梗上最容易观察。B. sparsiflora的花梗毛状体是简单的（rarely spurred or occasionally absent），平均长度>0.5 mm，而B. cobrensis × fernaldiana的花梗毛状体是树突状分枝的，平均约0.2 mm。B. bodiensis显得 intermediate，具有更 robust、较少分裂的树突状毛状体，平均>0.3 mm。开花茎中部的照片强化了毛状体的区别，并突出了茎直径以及叶子大小、形状和着生方式的差异。B. bodiensis的平均茎直径 intermediate，但其叶子更接近于B. sparsiflora，尺寸更大，基部最宽，具有发育良好的 auricles。比较开花前的主茎花蕾，B. sparsiflora可通过其更大（>3 mm）、椭球状（vs. 卵球状）的芽与B. bodiensis和B. cobrensis × fernaldiana区分开。然而，在盛花期，B. bodiensis的花更接近于B. sparsiflora。这些分类群通常具有平均>6 mm的 lavendar-rose 花瓣，而B. cobrensis × fernaldiana的花瓣是 whitish（远端罕见 lavendar-tinged），大多<6 mm。值得注意的是，B. bodiensis的花瓣在初花期通常是 whitish（像假设的B. cobrensis × fernaldiana亲本），而西部大盆地B. sparsiflora的花瓣从一开始就是 lavendar-rose。B. sparsiflora的俗名是 sickle-pod rockcress，其起源在检查接近成熟的果实时显而易见。这些强烈弯曲的果实通常比其他分类群的更宽，并且硬化的 valves conceal 了种子。相反，B. cobrensis × fernaldiana的更窄的果实是直的或略微弯曲，具有更薄的 valves，突出了单个种子的位置。B. bodiensis的果实在这些特征中的每一个方面都介于其假设亲本之间。三个分类群的成熟种子在形状和翅发育上通常相似，但也提供了杂交 intermediacy 的显著例外。B. bodiensis的种子 consistently 大于两个二倍体PPLs的种子，可能是由于所有种子组织的更高倍性所致。B. bodiensis的种子也与B. sparsiflora和B. cobrensis × fernaldiana的种子在种皮 texture 和 reflectance 上有所不同。在有限的观察中（种子很少存在于标本馆标本上），B. bodiensis的种子具有微粗糙（不发光）的表面，而两个PPLs的种子是光滑的，并且通常看起来 polished。

Boechera bodiensis是结合了B. cobrensis、B. fernaldiana和B. sparsiflora基因组的OTU的正确名称

由于用于我们BMW分析的查询标本是Arabis bodiensis的 holotype，适用于更广泛OTU的命名法相对 straightforward。微卫星DNA表明，holotype sheet上的唯一植株（提取号FW504的来源）是一个三倍体杂交种，其基因组来源于三个有性二倍体分类群：B. cobrensis、B. fernaldiana和B. sparsiflora。对BMW中目前包含的3000多份多倍体标本进行的等位基因相似性分析，确定了另外31份结合了这三个分类群基因组的样本。这31份中没有代表其他已发表名称的模式标本，形态学研究表明，尚未采样的、具有模式标本的任何有效名称都不适用于此OTU。因此，我们有信心认为，这种基因组组合的最早有效种名是Arabis bodiensis，其在当前分类下的正确名称是Boechera bodiensis。

Boechera bodiensis：建立新的基线

我们的分析也确定了围绕Boechera bodiensis的分类学混淆的主要来源。我们获得了Rollins（1982）在 protologue 中研究和引用的14份标本中12份的微卫星数据，两个未采样的 collection 是包含在我们分析中的其他标本的副本。其中七份（GH holotype, DS isotype, 加上所有五份Tom Messick的采集物）被 confirmed 包含来自B. cobrensis、B. fernaldiana和B. sparsiflora的基因组（=B. bodiensis）。另外四份（加上两个未采样的副本）由Wiggins和Rollins在模式产地附近采集，代表了先前被忽视的OTU B. cobrensis × fernaldiana × fernaldiana。Rollins（1982）引用的唯一来自内华达州的 paratype（Alexander and Kellogg 4449）属于另一个未命名的OTU，B. cobrensis × fernaldiana × pendulocarpa。

发现Rollins（1982）在Arabis bodiensis的 protologue 中引用的一半采集物并不严格代表该物种，这有助于解释为什么分类学问题悬而未决如此之久。原始描述（以及Rollins的 identification key）结合了三种不同三倍体杂交种的形态特征 states，使得识别遗传上一致的OTU成为不可能。这进而严重破坏了后续确定物种保护 status 的努力。一项 otherwise exemplary 的内华达州潜在A. bodiensis种群调查恰当地说明了这种分类学混淆造成的损害。在给美国鱼类与野生动物管理局的最终报告中，Morefield（1994）列出了六个新的A. bodiensis种群，总计2048株植物，分散在大约133英亩的土地上。然而，我们对Morefield收集的 voucher 标本进行的微卫星分析显示，六个种群中的五个（总计约1600株植物，分布在100英亩上）代表的是B. cobrensis × fernaldiana × fernaldiana，而不是B. bodiensis。B. bodiensis出现在第六个地点，但它与B. cobrensis × fernaldiana × fernaldiana混合生长，使得种群大小估计（400株个体分散在35英亩上）变得没有意义。

先前对Boechera bodiensis的界定（Rollins, 1982, 1993; Morefield, 1994; Holmgren, 2005; Al-Shehbaz and Windham, 2010; Windham and Al-Shehbaz, 2012）远远偏离了目标，我们需要为未来的分析建立一个新的基线。根据这项研究，我们得出结论，B. bodiensis是一个无融合生殖三倍体杂交种，其独特定义在于存在来源于B. cobrensis、B. fernaldiana和B. sparsiflora的基因组。我们的微卫星DNA分析现在包括了先前被鉴定为Arabis（Boechera）bodiensis的所有标本的90%以上。这次扩展采样的结果与Rollins（1982）引用的子集 closely paralleled；大约一半的采集被错误识别，其中大多数代表B. cobrensis × fernaldiana × fernaldiana。这种高错误率主张对B. bodiensis的基线形态和地理界定的 inclusion 应采取非常保守的阈值。未 voucher 的观察和野外照片价值不大（除了指导后续的野外工作），缺乏微卫星数据的采集应被排除，直到形态与基因组构成之间的相关性得到更牢固的确立。

我们对被鉴定为Arabis（Boechera）bodiensis的植物近乎完整的微卫星采样已经记录了32份历史采集具有B. cobrensis × fernaldiana × sparsiflora的基因组构成。这代表了一个地理上 cohesive 的OTU，在形态上可与其直接亲本以及《北美植物志》中认可的所有其他分类群区分开。将B. bodiensis与其最常混淆的先前未检测到的三倍体进行额外比较表明，迄今为止发现的所有OTU在形态上都是可识别的，修订后的分类学处理将单独发表（Windham et al., in prep.）。在此基础上，我们正在进行另一轮野外工作，探索B. bodiensis及其近缘分类群的遗传变异性、人口统计和生态学，并评估现存种群的 current status 和威胁。有了这些数据，我们将处于更有利的位置来解决B. bodiensis是否符合《濒危物种法案》保护标准的长期问题。

本研究解决了围绕Boechera bodiensis的长期分类学不确定性，确定其为三倍体、二倍体无融合生殖（diplosporous apomict），其亚基因组来源于B. cobrensis、B. fernaldiana和B. sparsiflora。通过整合来自Boechera微卫星网站（BMW）的微卫星基因分型和详细的形态学分析，我们确认B. bodiensis代表一个遗传和形态上 distinct 的谱系，主要局限于加州Mono县。这些发现不仅澄清了其物种 status 和分布，而且强调了其作为稀有和狭窄地方性无融合生殖植物的保护重要性。更广泛地说，这个案例 exemplify 了BMW作为解决Boechera属中复杂杂交关系的分类学和进化工具的威力。使用BMW的分析迄今已识别出355个基因组 distinct 的通过无融合生殖繁殖的杂交谱系。像B. bodiensis一样，这些谱系每一个都有一个引人入胜的进化故事要讲述，而BMW在重建这些叙事中扮演着 absolutely 关键的角色。该研究发表在《Annals of Botany》上，为理解植物中杂交、多倍化和无融合生殖的复杂相互作用提供了重要的见解，并对生物多样性保护和物种界定具有实际意义。