代谢工程改造谷氨酸棒杆菌高效生产新型紫外线A保护剂C50类胡萝卜素十聚异戊二烯黄质及其抗氧化活性与绿色提取工艺研究

本研究针对天然C50类胡萝卜素十聚异戊二烯黄质开发不足的问题，通过基因组编辑和质粒过表达技术强化谷氨酸棒杆菌代谢通路，成功实现摇瓶230 mg L-1和2 L补料发酵1450 mg L-1的全球最高产量。系统解析葡萄糖苷化对溶解度和抗氧化活性（DPPH法EC50 6.5 μg mL-1）的增强效应，建立乙醇绿色提取工艺，为天然紫外线防护剂和抗氧化剂开发提供新策略。

　　

在化妆品、食品和饲料工业中，类胡萝卜素作为天然色素和功能活性成分备受青睐。目前市场上主流的是C40类胡萝卜素（如β-胡萝卜素和虾青素），而具有更长共轭双键系统的C50类胡萝卜素尽管展现出更强的光保护性和抗氧化潜力，却因产量低、研究少而未能实现规模化应用。特别是谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）天然合成的十聚异戊二烯黄质（decaprenoxanthin）——一种罕见的葡萄糖苷化C50类胡萝卜素，虽被专利认证可作为紫外线A防护剂用于防晒产品，但其代谢调控机制、规模化生产及应用特性仍不明确。

针对这一瓶颈，德国比勒菲尔德大学的研究团队在《Bioresource Technology》发表了一项突破性研究。他们通过多维度代谢工程策略，成功构建了高效生产十聚异戊二烯黄质的细胞工厂，并系统评估了其生物活性与产业化潜力。该研究不仅创造了C50类胡萝卜素的最高生产纪录，更首次揭示了葡萄糖苷化修饰对产品理化性质和抗氧化活性的增强作用，为天然紫外线防护剂的开发提供了全新解决方案。

研究采用基因组编辑（CRISPR-Cas9介导的同源重组）和质粒过表达相结合的技术策略。关键操作包括：① 删除转录抑制因子crtR基因解除反馈抑制；② 强化MEP途径限速酶dxs（1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶）的启动子；③ 整合异戊烯基焦磷酸异构酶（idi）和牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶（idsA）的合成操纵子；④ 构建携带crtE（GGPPS）、crtB（八氢番茄红素合酶）和crtI（八氢番茄红素脱氢酶）的诱导型表达质粒。发酵研究采用2 L规模补料发酵系统，分析检测依托高效液相色谱（HPLC）定量和DPPH自由基清除实验评价抗氧化活性。

3.1 培养基优化揭示特异性营养需求

研究发现，针对虾青素优化的CGAST1培养基反而降低十聚异戊二烯黄质产量，表明C50与C40类胡萝卜素的代谢调控存在显著差异。最终确定标准CGXII培养基更适合十聚异戊二烯黄质生物合成，这为后续工艺放大奠定了基础。

3.2 多靶点代谢工程显著提升产量

通过系统改造MEP途径（dxs启动子替换）和GGPP供应模块（idsA-idi整合），工程菌株DECA的产量达到127.6 mg L^-1。叠加质粒过表达crtEBI操纵子后，摇瓶产量进一步提升至229.6 mg L^-1，证明前体供应与转化酶的协同强化是关键。

3.3 葡萄糖苷化工程调控产物特性

过表达原生crtX（葡萄糖基转移酶）使二葡萄糖苷化比例提高至90%，但总产量有所下降，推测与UDP-葡萄糖代谢负担有关。有趣的是，在柑橘皮水解物培养基中，葡萄糖苷化程度显著提高，提示底物组成影响糖基化效率。

3.4 2 L补料发酵实现克级产量

规模放大后，菌株在115 g L^-1细胞密度下产生1450 mg L^-1十聚异戊二烯黄质（83%为二葡萄糖苷形式），生产强度达21 mg L^-1 h^-1，是目前C50类胡萝卜素的最高报道产量。

3.5 替代碳源利用展现工艺柔性

工程菌能利用木糖、阿拉伯糖和甘油等非粮碳源，特别是在柑橘皮水解物中产量达140.5 mg L^-1，证明了农业废弃物资源化利用的可行性。

3.6 葡萄糖苷化增强抗氧化活性

DPPH实验显示葡萄糖苷化十聚异戊二烯黄质的EC₅₀为6.5 μg mL^-1，接近维生素C（5.8 μg mL^-1）且显著优于未糖基化形式（11.9 μg mL^-1）和合成抗氧化剂BHT。但该化合物对UV-A光照敏感，6小时后完全降解。

3.7 乙醇绿色提取工艺确立

80-90%乙醇溶液对糖基化和非糖基化十聚异戊二烯黄质的提取效率与甲醇-丙酮混合溶剂相当，满足了化妆品原料的安全生产要求。

该研究通过系统性代谢工程创造了迄今最高产的C50类胡萝卜素微生物细胞工厂，其2 L发酵规模产量（1450 mg L^-1）远超卤古菌来源的细菌红素（最高556 mg L^-1）。研究首次证实葡萄糖苷化修饰能显著提升十聚异戊二烯黄质的抗氧化活性（EC₅₀降低45%）和水溶性，这为理解糖基化修饰与生物活性关系提供了新视角。建立的乙醇提取工艺和替代碳源利用策略，不仅符合绿色化学原则，更大幅降低了产业化壁垒。

值得注意的是，柑橘皮水解物培养基可同时提高产量和糖基化程度，这暗示天然基质中的某些成分可能调控糖基转移酶活性或UDP-葡萄糖代谢通量。虽然UV-A下的光不稳定性可能限制其在防晒剂中的直接应用，但其强抗氧化性和紫外线吸收特性仍使其在抗衰老化妆品、功能性食品及医药领域具有广阔前景。该研究成功将基础代谢工程研究推向产业化边缘，为稀有C50类胡萝卜素的商业化开发奠定了技术基础，同时也为微生物细胞工厂的构建提供了可借鉴的多靶点协同调控策略。