发热温度增强恶性疟原虫环状体期对脑微血管内皮细胞的粘附作用及其在脑型疟疾发病机制中的意义

本刊推荐：为解决脑型疟疾(CM)中寄生虫滞留机制不明的问题，研究人员开展发热温度对环状体期恶性疟原虫(P. falciparum)粘附性影响的研究。发现发热条件(40°C)通过上调寄生虫输出组(exportome)基因表达，加速PfEMP1表面展示，使环状体期感染红细胞(IE)在3D脑微血管模型中粘附增加两倍，并首次发现高寄生虫血症可促进未感染红细胞(UE)粘附。这些发现揭示了发热与寄生虫生物量在脑型疟疾发病中的复杂相互作用。

　　

在热带地区肆虐的疟疾仍然是全球重大的公共卫生问题，其中由恶性疟原虫（Plasmodium falciparum）感染引起的脑型疟疾（Cerebral Malaria, CM）是最致命的并发症之一。患者会出现昏迷、抽搐等严重神经系统症状，死亡率极高。长期以来，科学家们认为脑型疟疾的发生与寄生虫在脑部微血管中的"滞留"现象密切相关——成熟期的寄生虫（滋养体和裂殖体）通过表达一种称为恶性疟原虫红细胞膜蛋白1（PfEMP1）的变异抗原，像"魔术贴"一样粘附在血管内壁上。然而，近年来有证据表明，原本被认为主要在血液循环中自由移动的环状体期寄生虫，在重症患者体内也会神秘消失，提示它们可能同样参与了微血管滞留的过程。

更令人困惑的是，发热作为疟疾的典型症状，是否会影响寄生虫的滞留行为？虽然之前有研究发现发热温度能增强环状体期寄生虫对CD36和ICAM-1等受体的粘附，但这些研究都是在二维静态模型中进行，无法模拟真实脑微血管的三维环境和血流动力学特征。特别是对于与脑型疟疾密切相关的内皮蛋白C受体（EPCR）结合型寄生虫，发热是否会影响其滞留特性完全未知。此外， autopsy（尸检）研究显示脑型疟疾患者的脑微血管中不仅充满了被感染的红细胞，还有大量未感染的红细胞，这些细胞如何贡献于微血管堵塞也是一个未解之谜。

为了解决这些关键问题，由Fatou Joof、Ruoqian Hu、Karl B. Seydel、Lauren M. Cohee、Ying Zheng和Joseph D. Smith组成的研究团队开展了一项创新性研究。他们利用先进的3D脑微血管模型，模拟人体内的真实环境，深入探究了发热温度对环状体期寄生虫粘附行为的影响，以及高寄生虫血症对未感染红细胞粘附的作用。他们的研究成果发表在《The Journal of Infectious Diseases》上，为理解脑型疟疾的发病机制提供了重要新见解。

研究人员主要应用了几项关键技术：首先使用纳米字符串（nCounter）技术分析寄生虫输出组基因的转录水平变化；通过流式细胞术检测PfEMP1蛋白的表面展示情况；最重要的是构建了可灌注的3D人脑微血管模型来模拟体内环境；并使用来自马拉维队列研究的人类血浆样本来保证研究的临床相关性。

发热温度升高环状体期恶性疟原虫输出组转录本水平

研究人员首先模拟疟疾发热 episode（发作），将环状体期寄生虫（0-6小时 post invasion, hpi）在40°C条件下处理4小时，然后恢复至37°C培养4小时。通过nCounter技术分析发现，发热处理显著上调了多个输出蛋白基因的转录水平。在代表脑型疟疾的IT4var19寄生虫株中，21个基因表达上调，而在代表胎盘疟疾的FCR3CSA株中也有10个基因上调，其中8个为共同响应基因。特别值得注意的是，与PfEMP1运输相关的PTP基因家族（PTP3、PTP4、PTR6）、FIKK激酶家族成员（尤其是FIKK4.2）、分子伴侣HSP40以及红细胞稳定蛋白RESA等都显著上调。这些基因在寄生虫适应发热环境、加速抗原表面展示和增强细胞粘附中可能发挥关键作用。

发热条件加速环状体期PfEMP1表面展示

通过流式细胞术分析，研究人员发现发热处理显著提高了环状体期寄生虫的表面抗原性。在8-14 hpi时期，40°C处理组的表面阳性细胞比例（14.8% ± 3.5）显著高于37°C对照组（8.3% ± 2.1）。但随着寄生虫发育成熟，这种差异逐渐消失，到24-30 hpi时两组间已无显著差异。有趣的是，虽然表面阳性细胞比例有差异，但阳性细胞的平均荧光强度（MFI）在两组间并无显著不同，表明发热主要影响PfEMP1的表面展示时机而非单个细胞的抗原表达量。

发热处理使环状体期感染红细胞在3D脑微血管中的粘附增加两倍

研究人员接着使用3D脑微血管模型评估发热对寄生虫粘附功能的影响。他们将40°C处理和37°C对照的环状体期寄生虫分别用红色和绿色荧光膜染料标记，以1:1比例混合后灌注到微血管中。结果发现，发热处理组的寄生虫粘附数量（100 ± 16.5）几乎是对照组（52 ± 9）的两倍，具有显著统计学差异。不过，与成熟滋养体期寄生虫（24-30 hpi）的粘附能力（4204 ± 856）相比，环状体期寄生虫的粘附能力仍然低了40-80倍，说明尽管发热增强了环状体期的粘附能力，成熟期寄生虫仍然是微血管滞留的主要贡献者。

高寄生虫血症培养增加未感染红细胞在3D脑微血管中的粘附

一个意外的发现是，在实验过程中研究人员观察到未感染红细胞（UE）也会粘附在脑微血管上。进一步实验表明，与寄生虫共培养的未感染红细胞（1068 ± 141）比单独培养的未感染红细胞（282 ± 19.2）粘附数量显著增加。然而，发热处理本身对未感染红细胞的粘附没有显著影响：无论是否发热，与寄生虫共培养的未感染红细胞粘附数量都显著高于无寄生虫暴露的对照组。这表明高寄生虫血症环境而非发热温度本身，是导致未感染红细胞粘附性增加的主要原因。

这项研究的发现对理解脑型疟疾的发病机制具有重要意义。研究表明，发热温度通过上调寄生虫输出组基因表达，加速PfEMP1表面展示，从而增强环状体期寄生虫对脑微血管内皮的粘附能力。这可能是重症疟疾患者体内环状体期寄生虫快速从血液循环中消失的机制之一——发热 inadvertently（无意中）为环状体期寄生虫提供了早期"立足点"，使其能够更早地开始微血管滞留过程，可能逃避脾脏清除机制，导致更高的寄生虫负荷和更严重的疾病。

此外，研究发现高寄生虫血症环境能够促进未感染红细胞的粘附，这为理解脑型疟疾中的微血管堵塞提供了新视角。未感染红细胞的粘附可能通过多种机制贡献于微血管功能障碍：可能是由于寄生虫感染改变了红细胞的机械性能，使其变形能力下降；也可能是通过玫瑰花结形成等机制间接介导；还可能是寄生虫分泌的因子改变了红细胞表面特性。这种未感染红细胞的广泛粘附可能显著加剧微血管堵塞，导致组织缺氧和器官功能损伤。

研究的局限性在于使用的3D微血管模型直径较大（约100μm），无法完全模拟体内更细的毛细血管（5-10μm）中的血流动力学特性。未来需要在更细的毛细血管模型中进行研究，以更好地理解发热和寄生虫密度对微血管堵塞的综合影响。此外，研究只考察了静息状态下的内皮细胞，而实际疟疾感染中发热常伴随炎症反应，炎症细胞因子如肿瘤坏死因子（TNF）可能改变内皮细胞表面受体表达，进而影响寄生虫粘附特性。

总之，这项研究揭示了发热温度和高寄生虫血症在调节恶性疟原虫与脑微血管内皮相互作用中的重要作用，为开发针对脑型疟疾的新治疗策略提供了重要理论基础。针对发热诱导的寄生虫粘附机制和未感染红细胞粘附途径的干预，可能为减轻脑型疟疾的严重程度提供新的治疗思路。