MicroRNA miR-196a通过抑制非洲爪蟾胚胎中未成熟神经外胚层程序调控神经嵴模式形成

本研究聚焦于神经嵴（NC）发育过程中microRNA（miRNA）功能的缺失问题，通过靶向抑制miR-196a，揭示了其在非洲爪蟾胚胎神经嵴模式形成中的关键作用。研究人员发现miR-196a缺失导致颅面骨骼缺陷，并伴随神经板边界（NB）和NC标志物表达紊乱。通过RNA测序和功能验证，研究明确了miR-196a在平衡神经前体细胞与NC/基板分化中的核心调控功能，为神经嵴相关先天疾病提供了新的分子机制见解。

　　

在脊椎动物胚胎发育过程中，神经嵴（Neural Crest, NC）细胞是一类多能干细胞群体，它们在神经形成期被特化，经历上皮-间质转化（Epithelial-to-Mesenchymal Transition, EMT）后广泛迁移，最终分化为颅面骨骼、周围神经系统和色素细胞等多种组织与细胞类型。神经嵴的规范过程受到一个复杂且尚未完全阐明的基因调控网络（NC-GRN）的控制，其中microRNA（miRNA）的作用尤其缺乏深入表征。miRNA是一类长约20-22个核苷酸的非编码RNA，通过转录后抑制机制调控基因表达。由于miR-196a在非洲爪蟾（Xenopus laevis）胚胎的发育中的神经和NC细胞中表达，本研究旨在探讨miR-196a在NC-GRN中的功能。

目前，关于特定miRNA在NC发育中的具体作用仍知之甚少。先前的研究表明，一些神经嵴病变（neurocristopathies）与miRNA表达异常相关，提示miRNA可能成为这些疾病的治疗靶点。然而，miR-196a在NC发育中的功能机制尚未明确。为了解决这一问题，研究人员利用反义吗啉寡核苷酸（Morpholino, MO）敲低miR-196a的表达，系统研究了其对NC发育的影响。

本研究采用的主要关键技术方法包括：利用吗啉寡核苷酸（MO）进行基因敲低，通过显微注射技术靶向非洲爪蟾胚胎特定区域；采用整体原位杂交（WISH）分析基因表达模式；通过RNA测序（RNA-Seq）对神经板边界（NB）和神经嵴（NC）外植体进行转录组分析；使用qRT-PCR验证miRNA表达水平；并通过阿尔新蓝（Alcian blue）染色评估颅面软骨形态。实验样本来源于非洲爪蟾胚胎，所有操作符合英国Home Office相关规定。

研究人员首先设计并验证了针对miR-196a的特异性MO（miR-196a-MO）及其错配对照（miR-196a-MM）。qPCR结果显示，miR-196a-MO能剂量依赖性地降低miR-196a表达，而错配对照无此效应。表型分析发现，miR-196a敲低导致胚胎出现颅面缺陷，如鳃弓不对称和软骨结构减少，这些表型可通过共注射miR-196a模拟物（mimic）得以挽救。

miRNA 196a是神经嵴源性颅面发育所必需的

通过 unilateral injection（单侧注射）策略，研究人员在阶段28的蝌蚪中观察到，miR-196a敲低侧分支弓结构缺失，而对照侧正常。阿尔新蓝染色进一步证实，突变体中麦克尔软骨和腭方软骨缺失，但中线骨骼结构未受影响。其他NC衍生物（如黑色素细胞和鳍间充质）则正常，表明miR-196a specifically调控颅部NC衍生组织。

miRNA-196a调控背侧外胚层模式形成

通过 whole mount in situ hybridization（整体原位杂交），研究人员发现，在神经胚阶段，miR-196a敲低导致NC标志物（如snai2、sox10）和神经板边界（NB）标志物（如pax3）表达缺失。同时，神经板（NP）标志物（如sox2、sox11）和NP/NB标记（如zic1/3）表达扩展，而侧部NB标志物msx2在前部NB区域缺失。此外，神经元分化标志物（如tubb2b和elrC）表达减少，表明miR-196a缺失不仅影响NC特化，还抑制了神经分化。

miR-196a突变型NC前体细胞的转录组显示NC和基板缺失、未成熟神经程序扩展以及BMP/Notch信号异常

RNA测序分析显示，miR-196a敲低导致NB和NC外植体中2400多个基因差异表达。在阶段14，NC标志物（如snai2、sox8、sox9）表达下降；而在阶段17，前神经标志物（如sox2/3）和多能性基因（如pou5f3）表达异常升高。BMP信号拮抗剂chordin表达上调，提示BMP信号水平失衡可能导致NB模式化缺陷。此外，Notch信号效应物（如hes4）和细胞周期调控因子（如cdc25b）表达紊乱，表明miR-196a通过调控多能性和分化平衡影响NC发育。

研究结论表明，miR-196a在非洲爪蟾胚胎背侧外胚层模式形成中发挥关键作用。其主要功能包括：限制神经命运扩展，促进NC和基板特化；抑制多能性和神经干细胞基因表达，促进神经元分化。miR-196a缺失导致NC形成失败，颅面发育缺陷，且这些缺陷无法在后期补偿。通过miRanda分析，研究人员预测了miR-196a的直接靶基因，如sox10、hand1和多个Hox基因，并通过功能实验验证了sox10的表达受miR-196a直接调控。这些发现不仅深化了对NC-GRN的理解，还为神经嵴病变的机制研究和潜在治疗策略提供了重要依据。本研究发表在《Developmental Biology》上，强调了miRNA在胚胎发育中的精细调控作用，为相关领域的研究提供了新的方向和思路。