基于欧洲多中心真实世界数据探索NGS在肉瘤诊断与治疗中的临床价值与分子景观

本研究针对肉瘤诊断复杂性和治疗靶点匮乏的临床难题，通过多中心真实世界数据分析，系统评估了NGS技术在肉瘤分子分型与精准治疗中的应用价值。研究发现NGS融合检测可修正8.9%患者的诊断，鉴定出TP53、RB1等高频突变及EWSR1-FLI1等特征性融合，19.5%变异具有临床可操作性。该研究为肉瘤的分子诊断规范建立和靶向治疗策略提供了重要循证依据。

　　

肉瘤作为一组起源于间叶组织的恶性肿瘤，其诊断和治疗始终面临巨大挑战。这类肿瘤具有高度异质性，世界卫生组织(WHO)最新分类中收录的软组织肉瘤(STS)和骨肉瘤亚型超过120种，其中超过三分之一需要依靠特异性基因组变异才能准确分类。传统的病理学诊断即使由经验丰富的专家进行，仍存在相当比例的诊断分歧。更棘手的是，由于肉瘤的罕见性和分子数据的缺乏，针对特定分子亚型设计前瞻性临床试验极为困难，导致绝大多数患者仍以细胞毒性化疗为主要治疗手段。

在这种背景下，下一代测序(NGS)技术为肉瘤的精准医疗带来了新的希望。然而，不同机构使用的NGS检测panel和技术平台存在差异，且肉瘤本身具有突变负荷低、可靶向变异罕见等特点，使得NGS在真实世界临床实践中的价值仍存在争议。特别是欧洲范围内，缺乏综合评估NGS对肉瘤诊断和治疗影响的大规模研究。

为此，来自希腊、波兰和西班牙六个肉瘤专家中心的研究团队开展了这项回顾性研究，旨在基于真实世界数据评估NGS在肉瘤诊断和治疗中的临床价值，并识别潜在的治疗靶点。该研究最终发表于《ESMO Open》期刊，为肉瘤的精准医疗实践提供了重要证据。

研究人员采用多种关键技术方法开展研究：收集了2008-2023年间694例肉瘤患者的临床样本和数据，样本来源于希腊(3个中心)、波兰(1个中心)和西班牙(2个中心)的多机构队列；使用福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)肿瘤组织进行DNA和RNA提取；应用多种NGS检测平台包括FoundationOne? CDx、Archer? FusionPlex? Sarcoma系列panel以及自定义的300基因扩增子测序panel；在Illumina? NovaSeq 6000、Miniseq、Nextseq 500和Ion GeneStudio S5系统等测序平台上进行检测；使用专业生物信息学软件(Foundation Medicine专用系统、Archer Analysis v6.2、IonTorrent Thermo Fisher Scientific v5.2)进行数据分析；采用ChimerDriver和Oncofuse工具进行基因融合功能分析；基于OncoKB v4.21分类系统定义“潜在可操作突变”；使用R语言v4.4.1进行统计分析和可视化。

描述队列特征方面，研究纳入了694例软组织和骨肉瘤患者，中位年龄46.5岁(范围0-89岁)，男性占54.5%。大多数为局限性疾病患者(58.1%)，38.3%为转移性患者。共鉴定出90种不同的肉瘤组织学亚型，其中软组织肉瘤占81.1%(563例)，骨肉瘤占17.9%(124例)。最常见的亚型包括平滑肌肉瘤(10.1%)、尤文肉瘤(7.5%)和未分化多形性肉瘤(7.3%)。

NGS在诊断中的作用方面，研究发现8.9%(62例)的患者通过NGS检测改变了诊断。其中54例从一种肉瘤亚型重新分类为另一种肉瘤亚型，6例从其他类型癌症更正为肉瘤诊断，2例从黑色素瘤更正为肉瘤，另有2例从良性间叶性病变和行为不确定的肿瘤最终诊断为肉瘤。在31例中，发现的遗传变异对特定肉瘤的诊断具有决定性意义，其中24例的诊断改变对后续治疗策略产生了影响。最常被重新分类的亚型是未分化梭形细胞肉瘤(9例)和黏液纤维肉瘤(5例)，分别占各自进行NGS检测患者的35%和16%。

突变谱和可操作变异方面，研究在331例患者中发现了519个突变，平均每位患者1.57个变异。遗传和基因组变异包括小规模突变(269个)、融合(179个，含3个截断变异)和扩增(71个)。最常突变的基因是TP53(14.9%)，其次是RB1(4.8%)、PIK3CA(4%)、CDKN2A(3.3%)、CTNNB1(3.3%)、IDH1(3.3%)、NF1(3.3%)、CHECK2(3%)、PTEN(3%)和BRCA1/2(2.2%)。关于基因扩增，CDK4和MDM2基因分别在11.2%的病例中发生扩增。最常见的基因融合是EWSR1-FLI1、NAB2-STAT6和CIC-DUX4，分别与尤文肉瘤、恶性孤立性纤维瘤和CIC重排肉瘤相关。根据OncoKB标准，135个变异(19.5%)被认定为可操作，另有4个变异(0.6%)被研究者认为可操作但与OncoKB分类不一致。

NGS用于治疗目的的临床获益方面，仅有17例患者(占总队列的2.4%)接受了NGS匹配治疗。其中只有5例患者表现出临床获益(定义为治疗持续时间超过6个月)，且未报告客观缓解。在这5例患者中，2例检测到BRAF突变，使用BRAF和MEK抑制剂治疗持续时间分别为12和19个月；1例ALK突变使用ALK抑制剂克唑替尼治疗持续20个月；1例TP53突变使用西罗莫司治疗6个月；1例IDH1突变软骨肉瘤使用新型IDH1抑制剂治疗6个月。

研究结论和讨论部分强调，NGS和其他高通量技术越来越多地用于临床常规检测分子变异，主要用于治疗目的。然而，作为特殊性，非NGS分子研究在肉瘤中的作用已在诊断相关性方面得到充分证实。最新WHO骨和软组织肉瘤分类仅基于分子发现就纳入了新的肿瘤实体，凸显了分子生物学诊断在这些肿瘤中的深远重要性。本研究结果显示，8.9%的患者通过NGS结果改变了诊断，其中8例(1.15%)最终导致了不同的治疗方法。因此，由具有肉瘤专业知识的病理学家酌情进行的诊断性NGS检测对少数患者是有帮助的，尽管具有临床意义。

各种以识别治疗靶点为主要目的的NGS研究一致表明，TP53、RB1、CDK4、CDKN2A、MDM2、ATRX和PTEN的改变是转移性肉瘤中最常受影响的基因，这与本研究队列的发现基本一致。具体到检测到的变异的可操作性，约20%(根据OncoKB为19.5%，不根据OncoKB为0.6%)的患者可以提供匹配的靶向治疗。然而，由于若干限制，只有2.6%的总队列根据分子发现接受了治疗，其中获得临床获益的患者更少。

综合来看，从本研究队列获得的数据，以及来自不同欧洲机构的各种真实世界场景和使用多种NGS panel的情况，很大程度上再现了先前顶尖单一机构的结果。从这个意义上说，NGS在肉瘤患者中能发现的遗传变异数量较少，同时从提供的匹配靶向治疗中获得临床益处的患者比例较小，这似乎是相当确定的。本研究中靶向治疗产生持久临床影响的突变是BRAF(2例)。相比之下，分子分析的诊断意义似乎已经确立，NGS在一些特定的挑战性情况下有助于诊断过程。然而，事先由肉瘤专家病理学家进行审查对于确定是否需要NGS至关重要。

因此，高通量技术在临床决策制定中，更具体地说，在基于检测到的可操作突变的治疗选择中的价值仍然是一个难题。欧洲肿瘤内科学会(ESMO)已发布了关于基因组检测在实体瘤中使用的建议。此外，获得替代药物超说明书使用的困难显著限制了NGS对肉瘤治疗和结局的潜在影响。由于本分析和报告研究中纳入人群的异质性，很难确定特定可靶向突变在特定肉瘤亚型中的相关性。几篇综述讨论了这个问题，主要结论是需要前瞻性临床试验来评估NGS在肉瘤治疗中的效用，但由于先前的原因，这种选择可能不可行。

本研究存在若干局限性，首先是分析的回顾性性质。此外，纳入的肉瘤组织学类型的巨大异质性限制了可得出结论的影响。而且，用于分子分析的不同平台是关于从希腊、波兰和西班牙中心驱动的分子数据一致性的混杂因素。同样重要的是要强调，没有纳入的患者样本使用了所有NGS panel进行分析。

本研究结果结合本文提及的报告研究，鼓励建立一个国际数据库，收集在肉瘤患者中检测到的可操作NGS突变，以便更好地理解它们在特定亚型中的作用，并设计具有有意义理论基础的前瞻性试验。希腊肉瘤和罕见癌症小组计划资助和协调一个国际数据库，该数据库将成为未来研究项目和临床试验的公开试点。最终，NGS在诊断过程中，应肉瘤专家病理学家的要求，在一些特定的挑战性情况下可能具有重要意义。然而，关于临床决策制定，使用NGS指导靶向可操作突变的治疗选择仍然是一个难题。