转录本差异使用分析工具在bulk与单细胞RNA测序中的全面性能评估与基准测试研究

为解决DTU（差异转录本使用）分析工具选择难题，研究人员系统评估了12种工具在bulk与单细胞RNA-seq数据中的性能。研究表明，edgeR、DEXSeq和LimmaDS适用于paired-end数据，DEXSeq和DSGseq适用于single-end数据，satuRn在单细胞数据中优于DTUrtle，Spycone在时间序列分析中表现突出。该研究为转录组学研究中工具选择提供了实证依据。

　　

在高等真核生物中，选择性剪接（Alternative Splicing, AS）是增加蛋白质多样性的重要机制，通过外显子跳跃、可变剪接位点使用等不同剪接方式，使单个基因能够产生多个转录本。当基因在不同条件间发生差异剪接时，即使基因总体表达水平不变，转录本的相对丰度也会发生变化，这种现象被称为差异转录本使用（Differential Transcript Usage, DTU）。DTU可能引发重要的功能后果，例如从编码蛋白的转录本转换为非编码转录本，或在不同功能的转录本之间切换。其中，异构体切换（Isoform Switching, IS）是DTU的一种特殊形式，关注最主要转录本的DTU变化。

尽管DTU在多种疾病中具有重要作用（例如癌症中19%的多转录本基因存在功能性的异构体切换），且与帕金森病等疾病相关，但由于分析工具的多样性和实验条件的复杂性，如何选择最适合的分析工具成为研究人员面临的挑战。以往的研究虽然进行了一些基准测试，但存在诸多局限：例如使用的比对工具已过时、未涵盖单细胞数据分析、未涉及时间序列数据、以及未全面评估新近开发的工具等。此外，随着单细胞RNA测序（scRNA-seq）技术的普及，对单细胞水平DTU分析的需求日益增长，而相关工具的性能尚未得到系统评估。

为解决这些问题，来自德国慕尼黑工业大学、汉堡大学等机构的研究团队在《NAR Genomics and Bioinformatics》上发表了全面评估DTU检测工具性能的研究。他们通过模拟数据和真实转录组数据集，系统比较了12种DTU分析工具在多种实验设置下的表现，包括单端（single-end）与双端（paired-end）测序、不同重复数、不同背景水平以及单细胞和数据时间序列数据。

研究团队采用的主要技术方法包括：利用RSEM模拟生成bulk RNA-seq数据，scDesign3模拟单细胞数据；使用STAR进行剪接感知比对；通过Salmon、kallisto、RSEM和Cufflinks进行转录本定量；应用多种DTU检测工具（如DEXSeq、DRIMSeq、satuRn、LimmaDS等）进行分析；使用精确度、召回率、FDR和F1分数等指标评估工具性能；并通过GO富集分析验证生物学相关性。使用的真实数据集包括前列腺癌数据集（GSE22260）和SARS-CoV-2感染时间序列数据（GSE157490）。

研究结果通过多个维度展开：

在整体性能评估中，研究发现工具的表现受数据类型和实验设置的显著影响。对于双端测序数据，edgeR、DEXSeq和LimmaDS表现最佳，其中LimmaDS在增加重复数时召回率提升最明显（>0.2）。而对于单端数据，DEXSeq和DSGseq是更好的选择。随着背景水平（即基因不发生差异表达的概率）的增加，DSGseq、DTUrtle和iso-KTSP的假发现率（FDR）显著上升，而DEXSeq、LimmaDS和satuRn的FDR受影响较小。在基因水平上，所有工具的精确度和召回率均有所改善，表明工具能准确检测发生DTU的基因，但在识别具体发生DTU的转录本方面仍存在挑战。

在不同场景下的性能分析显示，工具的表现还受到折叠变化（fold change）和转录本数量的影响。折叠变化越大，事件的检测率越高，从而提高了F1分数。转录本数量较多的基因也表现出更高的F1分数。通过将DTU事件分为三种场景（S1、S2和S3），研究发现DEXSeq在S2和S3场景（典型的DTU事件）中召回率最高，而在S1场景（仅一个差异表达转录本，更类似于差异基因表达）中召回率较低。edgeR和DRIMSeq在所有三种DTU事件中均保持较低的FDR。

在前列腺癌真实数据集上的基准测试中，不同工具检测到的DTU基因集合存在较大差异。iso-KTSP检测到的基因数量最多，但模拟数据显示其F1分数较低（0.25），表明可能存在较多的假阳性。而LimmaDS的F1分数较高（0.4），但在该数据集中检测到的基因数量有限。通过GO富集分析，发现所有工具（除DEXSeq外）均富集到钙黏蛋白结合（cadherin binding）这一术语，其中satuRn和LimmaDS共同检测到的8个DTU基因（如PFN1、HSPA8、PARVA、EPCAM）与前列腺癌相关，揭示了DTU分析在癌症研究中的潜在价值。

在单细胞数据分析中，研究比较了专为单细胞数据设计的DTUrtle和satuRn。在平衡数据集（两个细胞类型，细胞数相等）中，satuRn的召回率更高（达0.86），而DTUrtle的精确度更高（接近1）。随着细胞数量的增加，召回率逐渐提高。然而，在更接近真实情况的非平衡数据集（2-7个细胞类型，细胞数随机）中，两种工具的性能均下降。此外，研究还尝试了伪批量（pseudo-bulk）分析策略，即通过聚合单细胞计数形成元细胞（meta-cell）后再应用bulk分析工具。结果显示，在平衡数据中，该方法提高了召回率但降低了精确度；而在非平衡数据中，精确度和召回率均较低（约0.5和0.1），表明伪批量分析并非单细胞DTU分析的理想解决方案。

在时间序列异构体切换分析中，研究团队将表现较好的成对比较工具（DEXSeq、LimmaDS、satuRn）与专门设计的时间序列工具（TSIS和Spycone）应用于SARS-CoV-2感染的时序数据。成对比较工具检测到大量DTU基因（超过3000个），且DEXSeq和LimmaDS的结果高度重叠（1731个基因）。而时间序列工具检测到的基因数量较少，且TSIS和Spycone之间重叠基因仅48个。通过GO富集分析，发现成对比较工具富集到通用细胞功能术语（如钙黏蛋白结合、泛素相关术语），而Spycone独特地富集到MHC蛋白复合物结合和IgA结合等与免疫应答相关的术语，这与SARS-CoV-2感染后早期体液免疫响应机制相符，体现了时间序列分析在捕捉动态生物学过程方面的优势。

研究结论强调，DTU分析工具的选择应基于具体研究需求。对于双端测序数据，推荐使用edgeR、DEXSeq或LimmaDS；对于单端数据，DEXSeq和DSGseq是更好的选择；在单细胞数据中，satuRn在召回率方面优于DTUrtle；而对于时间序列数据，Spycone能更有效地识别具有生物学意义的动态变化。此外，研究还指出当前工具在区分不同DTU场景（特别是S1事件）方面的不足，以及单细胞转录本定量准确性等技术挑战。

讨论部分进一步展望了未来研究方向，包括开发能够区分不同DTU场景的工具、扩展单细胞数据分析以支持多细胞类型比较、以及利用不断发展的长读长测序技术提高转录本检测准确性。该研究为转录组学研究人员提供了工具选择的实践指南，并促进了我们对选择性剪接在基因表达调控中作用的理解。