基于核磁共振（NMR）的Humira及其生物类似物结构完整性分析：光应激条件下的比较研究

本综述系统探讨了核磁共振（NMR）技术在治疗性单克隆抗体（mAbs）及其生物类似物（biosimilars）结构可比性研究中的应用价值。研究以阿达木单抗（adalimumab，商品名Humira?）及其两种生物类似物（BS1/Yusimry?、BS2/Hadlima?）为模型，通过一维/二维NMR（1D/2D NMR）、圆二色谱（CD）、质谱（MS）、尺寸排阻色谱（SEC）及毛细管等电聚焦（icIEF）等多维度分析手段，揭示其在光应激条件下高阶结构（HOS）变化、甲硫氨酸氧化（Ox-Met）及聚集行为差异。结果表明，NMR可灵敏检测制剂缓冲液中单抗的局部构象变化，为生物类似物开发中的质量属性评估（CQAs）提供了原子水平的技术支撑。

　　

引言背景

生物类似物（biosimilars）是指在质量、安全性和有效性方面与已获批参照药（reference product）无临床意义差异的生物制品。单克隆抗体（mAbs）作为重要的治疗性蛋白，其高阶结构（HOS）的相似性评估是生物类似物审评中的核心环节。HOS包括蛋白质的二级结构（如α-螺旋、β-折叠）、三级结构（多肽链折叠）和四级结构（重轻链组装），直接影响抗体的抗原结合、效应功能及免疫原性。美国食品药品监督管理局（FDA）指南要求采用正交分析方法（orthogonal methods）全面评估关键质量属性（CQAs），包括纯度、翻译后修饰（PTMs）和HOS。

目前常用于HOS分析的技术包括圆二色谱（CD）、傅里叶变换红外光谱（FTIR）和核磁共振（NMR）光谱。其中，NMR技术具有原子级分辨率，能直接在制剂缓冲液中分析蛋白质构象动态，但受复杂制剂组分（如表面活性剂、缓冲盐）干扰较大。近年来发展的扩散过滤一维核磁（1D PROFILE）和二维异核多重量子相干（2D ¹H-¹³C HMQC）等方法，通过抑制小分子赋形剂信号，显著提高了单抗NMR谱图的质量和可比性。

本研究以阿达木单抗（adalimumab）及其两种生物类似物（BS1/Yusimry?、BS2/Hadlima?）为对象，系统比较了它们在正常条件和光应激条件下的HOS变化，并结合多种分析技术揭示了制剂配方和包装系统（CCS）对产品光稳定性的影响。

结果分析

一维和二维NMR谱图显示结构高度相似

通过扩散过滤的一维¹H NMR实验，研究人员成功抑制了制剂中柠檬酸、甘露醇、组氨酸等小分子信号的干扰，仅保留聚山梨酯20/80（PS20/PS80）和单抗的信号。在正常条件下，参照药和两种生物类似物的1D和2D NMR谱图高度重叠，视觉检查无法区分三者之间的差异。二维¹H-¹³C HMQC实验进一步提高了分辨率，通过检测丙氨酸（Ala）、缬氨酸（Val）、甲硫氨酸（Met）、苏氨酸（Thr）、亮氨酸（Leu）和异亮氨酸（Ile）等疏水区甲基信号，获得了更精细的HOS指纹图谱。

采用化学计量学方法（如主成分分析PCA、偏最小二乘PLS、Easy Comparability of HOS/ECHOS）对2D NMR数据进行定量分析，结果显示所有样品聚集在同一区域， Combined Chemical Shift Deviation（CCSD）值低于15 ppb，符合生物类似物可比性标准，证实了三者HOS的高度相似性。

光应激导致甲硫氨酸氧化和局部构象变化

光应激处理后，1D NMR谱图中在2.7 ppm附近出现氧化甲硫氨酸（Ox-Met）特征信号，参照药中Ox-Met信号强度显著高于两种生物类似物。2D ¹H-¹³C谱图进一步证实了该现象：参照药中出现两个新增Ox-Met交叉峰（对应两个甲硫氨酸残基氧化），而BS1和BS2仅出现一个Ox-Met信号（单个甲硫氨酸氧化）。通过积分计算发现，参照药中Ox-Met含量最高，且氧化程度与CCS透明窗口面积正相关（参照药：7.5 cm²；BS2：<5 cm²；BS1：2.0 cm²）。

尽管整体结构相似性系数仍高于0.97，但PLS分析显示光应激参照药在潜在变量LV1轴上明显分离。剔除Met/Ox-Met信号区域后，仍能观察到应力样品与对照品的分离，表明光诱导的结构变化不仅限于甲硫氨酸氧化，还涉及局部构象调整。通过将900 MHz Fab段 assignments（BMRB-52274）转移至完整单抗600 MHz谱图，研究人员识别出多个可能发生构象变化的残基，包括L175/L181、L186/L78、L136/L146、I2/I51和V190等，这些残多位于疏水核心或功能域界面。

圆二色谱显示二级结构稳定

远紫外CD（far-UV CD）谱图显示，所有样品在201-202 nm处出现正峰，217 nm处出现负峰，符合典型IgG1结构特征。BeStSel算法计算表明，未应激和光应激样品的二级结构组成（α-螺旋、β-折叠、转角等）无显著变化，β-折叠含量差异小于1%。这表明光应激虽引起氧化和局部构象调整，但未破坏整体二级结构框架。

尺寸变异和电荷异质性分析

尺寸排阻色谱（SEC）显示，光应激后参照药中高分子量物种（HMWS）从0.4%升至13.6%，单体含量下降，而两种生物类似物HMWS仅轻微增加（0.3%-1.9%）。非还原毛细管电泳（nrCE-SDS）进一步证实参照药中HMWS和低分子量物种（LMWS）显著增加，还原CE-SDS（rCE-SDS）则显示重链（HC）和轻链（LC）纯度下降3%。

毛细管等电聚焦（icIEF）分析发现，光应激后参照药酸性变体增加10.99%，主峰减少6.75%，碱性变体减少4.24%；而生物类似物变化幅度较小。质谱（LC-MS）分析证实，参照药重链上出现+32 Da（双氧加合）和+64 Da（四氧加合）氧化修饰，生物类似物则以+16 Da（单氧加合）为主，与NMR结果一致。

讨论与意义

本研究通过多技术联用策略，证实了NMR在制剂缓冲液中直接分析单抗HOS的可行性和灵敏度。光应激条件下，参照药与生物类似物表现出不同的氧化敏感性和聚集倾向，这可能源于配方差异（如组氨酸的抗氧化保护作用）和包装系统（CCS）设计（如透明窗口面积）。生物类似物BS1（Yusimry?）因CCS透明面积最小，表现出最优的光稳定性。

尽管CD未能检测到二级结构变化，但NMR成功揭示了原子水平的氧化修饰和局部构象扰动，体现了其在生物类似物可比性研究中的独特价值。未来工作需进一步探索氧化修饰对生物活性（如Fc效应功能、抗原结合）的影响，并拓展至其他应激条件（如热应激）下的HOS评估。

材料与方法亮点

样品处理：参照药Humira?及生物类似物BS1（Yusimry?）、BS2（Hadlima?）购自商业渠道，光应激实验遵循ICH Q1B Option 2条件（60小时可见光+12小时UV照射）。

NMR检测：使用600 MHz Bruker谱仪配备TCI低温探头，在45°C下采集1D扩散过滤（PFGSTE）和2D ¹H-¹³C HMQC谱图，实验时间分别为1小时和7小时。

辅助技术：CD使用0.1 cm光径池检测190-250 nm范围；SEC采用磷酸钾缓冲液体系；LC-MS通过Orbitrap Lumos和Agilent Q-TOF完成完整分子量和还原链分析；icIEF和CE-SDS使用ProteinSimple Maurice系统。

数据分析：NMR数据采用MestreNova BioHOS插件进行多变量分析；CD数据通过BeStSel算法解析二级结构；质谱数据通过BioPharma Finder和MassHunter处理。