慢性乙型肝炎患者血清HBsAg主要源自整合HBV DNA而非病毒颗粒——病毒颗粒对表面抗原水平的贡献可忽略

本研究发现，在慢性乙型肝炎患者中，病毒颗粒（VP）对血清乙肝表面抗原（HBsAg）水平的贡献极低，其主要来源为整合的HBV DNA；研究通过大样本临床数据分析及抗病毒治疗动态监测，揭示即便在HBV DNA高水平状态下，cccDNA对HBsAg产生的贡献也十分有限，这一发现对HBV感染机制理解与临床标志物应用具有重要价值。

　　

Abstract

Background

乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）存在于病毒颗粒（VP）和亚病毒颗粒（SVP）上，其产生既来源于共价闭合环状DNA（cccDNA），也来自整合到人类染色体中的HBV DNA。

Objective

本研究旨在计算VP和SVP对血清HBsAg水平的贡献，并探讨HBsAg的来源在多大程度上是cccDNA或整合的HBV DNA。

Method

通过分析慢性HBV感染者以及开始或停止抗病毒治疗后的患者的HBV DNA和HBsAg水平展开研究。

Results

在800例未接受抗病毒治疗的慢性HBV感染者血清样本中，HBeAg阴性且病毒载量较低的个体中，SVP与VP的比率超过1亿。在对12例患者启动核苷（酸）类似物（NA）治疗期间，尽管HBV DNA显著下降（作为cccDNA下降的代理指标），血清HBsAg的下降却微乎其微或根本没有。停止NA治疗后，直到HBV DNA达到非常高的水平之前，未观察到HBsAg水平的上升。

Conclusions

病毒颗粒对血清HBsAg水平的贡献不显著，尤其在HBeAg阴性患者中，VP/SVP比率远低于既往报道。cccDNA对HBsAg水平的贡献似乎仅在HBV DNA血清水平非常高时才显著，此时肝脏中的cccDNA含量产生的HBsAg量等于或超过整合HBV DNA的产量。

Introduction

慢性乙型肝炎病毒（HBV）感染影响全球超过2.5亿人，是肝硬化和肝细胞癌（HCC）的主要病因。通过血液中检测乙肝表面抗原（HBsAg）识别感染，并通过测量HBV DNA水平评估感染活动性。HBV DNA升高与未来发生肝硬化或HCC的风险增加相关，其定量用于选择患者进行抗病毒治疗或HCC监测，并用于评估治疗效果。HBsAg定量可作为HBV DNA的补充，用于评估临床分期；血液中HBsAg的消失意味着传播感染的风险极低（输血或器官移植除外），并且显著降低发生HCC或肝硬化的风险。HBsAg定量还可用于监测聚乙二醇干扰素治疗的应答。

HBV基因组以双链共价闭合环状DNA（cccDNA）的形式存在于肝细胞核中。这种表观遗传形式的基因组是所有病毒RNA的前体，包括前基因组RNA，其被病毒衣壳包裹并由病毒聚合酶进行逆转录。衣壳被包含HBsAg分子的膜包裹。血清中的HBV DNA水平反映了未经治疗的患者肝细胞中cccDNA的含量。HBV基因组的线性形式可能整合到人类染色体中并贡献HBsAg的产生，因此血清HBsAg水平是cccDNA和感染复制活性的间接且通常较差的标志物。此外，HBsAg既存在于病毒颗粒（VP）上，也存在于亚病毒颗粒（SVP）上，后者由紧密包裹HBsAg分子的脂蛋白膜组成，但不含病毒核酸内容。SVP的数量超过VP >103倍，并被提出有助于免疫耗竭以及中和抗体的结合，从而促进病毒的细胞间传播。然而，cccDNA和整合DNA在不同HBV感染阶段对HBsAg产生的相对贡献尚未确定。

在核苷（酸）类似物（NA）治疗HBV感染期间，由于NA对逆转录的直接作用，HBV DNA迅速下降。因此，血清中HBV DNA下降与cccDNA下降之间的相关性只能在治疗初期观察到，之后HBV DNA降至检测水平以下。由于NA治疗对cccDNA或整合DNA的HBsAg产生没有影响，HBsAg水平在短期内不受影响。

对于生命早期感染且仍处于血清中存在乙肝e抗原（HBeAg）的HBV感染阶段者，50-90%或更多的肝细胞被感染，每个感染的肝细胞中有1-5个cccDNA拷贝。最新数据表明整合过程开始得很早，一项研究估计，在成人HBeAg阳性个体中，平均每个肝细胞有2个整合。由于免疫反应，感染随时间变为HBeAg阴性，血清HBV DNA水平低得多。然而，血液中通常仍存在高浓度的HBsAg，因此HBsAg/HBV DNA比率增加，表明当病毒复制减少时，SVP/VP比率增加。

本研究关注两个问题：病毒颗粒是否显著贡献血清HBsAg水平？cccDNA在多大程度上贡献血清中的SVP和HBsAg水平？我们的结果表明答案分别是“否”和“非常少”。

Methods

Samples

分析了三组样本：1）800份来自慢性HBV感染患者（54例HBeAg阳性，746例HBeAg阴性；45%女性）的血清样本，这些患者未接受抗病毒药物治疗。这些样本作为常规诊断的一部分进行了HBV DNA和HBsAg定量。2）来自12例高HBV DNA水平的HBeAg阳性患者NA治疗第一年的血清样本，这些患者有足够的样本来确定HBV DNA和HBsAg动力学。3）来自3例在停止NA治疗后经历HBV DNA显著升高的患者的系列血清样本。

Virological analyses

血清HBV DNA水平通过Cobas 6800（Roche）定量。血清HBsAg水平通过Abbott Alinity（Abbott）定量。HBsAg检测的定量范围为0.05-250 IU/mL，通过1:1000预稀释，上限为250,000 IU/mL。

Ethics

研究方案符合2000年《赫尔辛基宣言》的伦理准则。对常规诊断中已分析过的HBV DNA和HBsAg水平进行回顾性调查获得了瑞典伦理审查局（Dnr 2022-01628-01）的批准。在这些病例中未获得知情同意，仅从作为临床研究一部分停止抗病毒治疗的三名患者那里获得了知情同意（经瑞典伦理审查局批准，Dnr 2019–04563）。

Statistics and calculations

HBV DNA和HBsAg水平通过描述性统计呈现。HBV DNA水平（IU/mL）通过乘以5.82（Roche在其2005年 assay 中引入IU时提供的转换因子）转换为拷贝/mL。本文中VP/mL被视为等于HBV DNA拷贝/mL（即忽略病毒颗粒可能含有HBV RNA）。与病毒颗粒相关的HBsAg量使用公式IU HBV DNA/5000000计算，并从测量的HBsAg量中减去。剩余的HBsAg通过公式1 IU HBsAg = 5百万 x 6 x 4 SVP = 12 x 10? SVP转换为SVP。该公式基于Désiré等人的发现，即1 IU HBsAg对应于5百万IU HBV DNA的HBsAg含量，1 IU HBV DNA代表5.82拷贝（≈6）HBV DNA，并且VP携带的HBsAg分子数是SVP球状形式的3.75或5倍（≈4）（180或240对48）。该公式未考虑SVP丝状形式含有更多HBsAg拷贝，这会导致SVP数量被高估，但由于丝状形式比球状形式少见（1-10%），这种影响很小：如果丝状体长200 nm并占SVP的10%，则SVP数量仅被高估2倍。

Results

Viral particles contribute negligibly to HBsAg levels

先前的一项研究表明，在具有高HBV DNA水平（通常为8-9 log?? IU/mL）的HBeAg阳性患者中，VP仅对血清HBsAg水平（通常≈5 log?? IU/mL）有边际贡献（1-2 log?? IU/mL）。我们通过比较800份临床血清样本中的HBV DNA和HBsAg水平（代表了广泛的HBV DNA水平范围）进一步探讨了VP和SVP之间的这种关系。HBeAg阳性和HBeAg阴性个体的平均年龄（SE）分别为29.7（1.75）和42.9（0.51）岁，平均HBV DNA水平分别为7.93（0.14）和3.03（0.04）log?? IU/mL，平均HBsAg水平分别为4.41（0.10）和3.14（0.04）log?? IU/mL。

如图所示，具有最高HBV DNA水平的样本其HBsAg水平约为5.0 log?? IU/mL。在HBV DNA水平较低的样本中，HBsAg水平并未成比例降低，许多HBV DNA浓度低于4.0 log?? IU/mL的样本其HBsAg水平高于4.0 log?? IU/mL，这远高于如果HBsAg如虚线所示成比例下降时的预期值。

图B显示了与A相同的数据，但使用Methods中描述的公式将HBsAg水平转换为SVP。在具有最高HBV DNA水平的样本中存在1013 SVP/mL，而在许多HBV DNA低于4.0 log?? IU/mL的样本中，SVP浓度高达1011-1012 SVP/mL。图C显示，SVP与VP的比率相应地从HBV DNA为9.0 log?? IU/mL的HBeAg阳性样本中的低于1000，增加到HBV DNA为3-4 log?? IU/mL的HBeAg阴性样本中的高于10?。

cccDNA seems to contribute marginally to SVP and serum levels of HBsAg

上述结果表明血清中的HBsAg水平基本上仅代表SVP，但并未揭示SVP中由cccDNA产生与由整合HBV DNA产生的比例。为了解决这个问题，我们使用了接受NA治疗患者的连续血清样本，并重点关注HBV DNA的第二阶段下降（图2），这被认为是反映了cccDNA的下降。通过选择治疗前HBV DNA水平高的患者，可以在HBV DNA水平降至检测限以下之前相对较长的时间内研究第二阶段。

图3和表1显示了12例HBeAg阳性患者在NA治疗第一年期间HBsAg和HBV DNA水平的变化。

HBV DNA的中位第二阶段下降为每月0.40 log?? IU/mL，而HBsAg几乎没有下降或仅极小下降（中位数每月0.012 log IU/mL）。尽管cccDNA显著减少，但HBsAg水平得以维持，表明基线时HBsAg水平的大部分是由整合的HBV DNA产生的。

cccDNA contributes substantially to HBsAg production when HBV DNA serum levels reach above a threshold

为了进一步探讨cccDNA对HBsAg水平的贡献，我们假设接受NA治疗超过5年的患者其血清HBsAg水平应仅由整合的HBV DNA产生，因为据报道cccDNA在3年后下降了99.9%。我们调查了三名在停止NA治疗后经历病毒学复发且HBV DNA血清水平显著升高的患者的HBV DNA和HBsAg变化模式。经过9至12年的NA治疗，他们的血清HBsAg水平分别降低了约1 log??单位，至3.39、3.03和2.16 log?? IU/mL。

在患者1中，停止NA后6个月HBV DNA增加至6.88 log?? IU/mL，伴随HBsAg微不足道（0.09 log??）的增加，如图4A所示。然而，HBV DNA进一步增加1.45 log??至8.26 log?? IU/mL，同时HBsAg增加1.50 log??至5.07 log?? IU/mL，表明cccDNA已变得比整合的HBV DNA更丰富，并且是HBsAg的主要来源。由于8.26 log?? IU/mL的HBV DNA仅转化为2.56 log?? IU/mL的VP相关HBsAg，观察到的HBsAg水平从3.57增加到5.07 log?? IU/mL不能归因于VP上的HBsAg，而应归因于cccDNA产生的SVP。

在患者2中，HBV DNA早期增加至7.78 log?? IU/mL，同时HBsAg增加1.26 log??至4.29 log?? IU/mL，这也表明cccDNA水平（或至少cccDNA表达）已增加到足以成为HBsAg的主要来源（图4B）。类似地，当患者3（其停止NA时的HBsAg水平为2.16 log?? IU/mL）的HBV DNA水平增加至6.02 log?? IU/mL时，伴随HBsAg增加1.52 log??（图4C）。总之，这些结果表明cccDNA仅在HBV DNA达到高于某一阈值水平时才贡献HBsAg产生，在该阈值下cccDNA产生的HBsAg量与整合DNA产生的量相等。值得注意的是，HBsAg的增加是短暂的，当重新开始治疗时（A和B），或在一名不必重新开始治疗的患者中（C），其迅速恢复到停止NA时的水平，甚至更低。

Discussion

在本研究中，我们调查了慢性HBV感染HBeAg阳性和HBeAg阴性阶段血清HBV DNA和HBsAg水平之间的关系——间接反映了病毒颗粒（VP）和亚病毒颗粒（SVP）之间的关系——以及cccDNA和整合DNA对血清HBsAg的相对贡献。我们发现病毒颗粒对血清HBsAg水平的贡献可忽略不计。在一个典型的HBV DNA为4.0 log?? IU/mL的HBeAg阴性患者中，我们估计SVP的数量超过VP的倍数高达10?或更多，这远高于通常声称的103–10?，尽管偶尔也讨论过更高的比率。我们还发现，在HBV DNA水平低于7–8 log?? IU/mL的个体中，cccDNA对血清HBsAg的贡献很小。

在慢性HBV感染中，肝细胞中的cccDNA池通过新形成的含有松弛环状（rcDNA）的衣壳再循环回细胞核或摄取外部VP来维持。HBV DNA的整合被认为是由双链线性HBV DNA（dslDNA）（逆转录的替代产物）插入染色体DNA的随机位置所致。由免疫激活引起的肝细胞更新可能导致cccDNA迅速下降，可能是由于有丝分裂期间细胞核中cccDNA分子的丢失或通过“非溶细胞”机制。相比之下，具有整合HBV DNA的肝细胞的有丝分裂产生带有整合的子代细胞。因此，仅当带有整合的细胞被没有整合的肝细胞（或干细胞）替代时，整合的HBV DNA才会减少。

在一项对9份HBeAg阳性样本的研究中，Désiré等人将VP与SVP分离，发现在VP部分中，1 IU/mL的HBsAg对应于5百万IU/mL的HBV DNA，并且SVP部分中的HBsAg水平大约是VP部分的1000倍。在本研究中，我们在具有非常高HBV DNA水平的HBeAg阳性样本中发现了类似的HBsAg与HBV DNA比率（图1C），但在HBeAg阴性样本中比率要高得多。在许多此类HBV DNA水平为3–4 log?? IU/mL的样本中，HBsAg保持在4 log?? IU/mL。通过应用基于Désiré等人发现的计算，我们得出结论：虽然在HBeAg阳性人群血清中约0.1%的HBsAg可归因于VP，但在大多数HBeAg阴性人群中，这一比例低至约0.00001%。

尽管有报道称SVP携带了血清中大部分的HBsAg，但cccDNA和整合HBV DNA对SVP（HBsAg）血清水平的相对贡献仍不清楚。为了解决这个问题，我们调查了接受NA治疗的HBeAg阳性患者血清中HBV DNA和HBsAg的下降率。通过选择治疗前病毒载量高的患者，我们在HBV DNA降至检测限以下之前获得了几个数值，并能够计算第二阶段斜率，这被认为是cccDNA下降的代理指标。然后我们比较了HBV DNA和HBsAg的下降率，假设如果cccDNA是SVP的唯一或主要来源，那么HBsAg将以与HBV DNA相似的速率下降。相反，如果整合的HBV DNA是唯一或主要来源，那么HBsAg将要么保持稳定，要么非常缓慢地下降。此外，如果治疗前肝细胞中cccDNA和整合HBV DNA的含量相似并且对SVP的贡献相等，那么如他人报道，治疗一年后cccDNA减少90%（1 log??）将导致HBsAg水平减少45%（0.26 log??）。

我们的研究结果扩展了先前报告的发现——大多数HBeAg阴性患者的HBsAg源自整合——至HBeAg阳性患者。在开始NA治疗的12例HBeAg阳性患者中，HBV DNA的第二阶段下降快至每月0.40 log?? IU/mL，表明cccDNA下降相对较快。同时的HBsAg下降速度慢了20多倍（每月0.012 log??），这种差异表明只有一小部分HBsAg源自cccDNA。相反，HBsAg的缓慢减少可能反映了带有整合HBV DNA的肝细胞的边际减少。如果cccDNA和整合HBV DNA以相似的速率转录，这些发现表明即使在HBeAg阳性阶段，当肝细胞可能含有每个肝细胞1-5个cccDNA分子时，整合的HBV DNA也 predominates over cccDNA。这可能进一步表明在HBeAg阳性患者中平均每个肝细胞可能存在多个整合。这一发现引人注目，但与先前一项研究的结果一致，而其他人报道的整合率要低得多，但这些比率似乎太低，无法解释NA治疗期间HBsAg缺乏下降的现象。

我们还采用另一种方法，通过调查三名接受NA治疗超过5年且出现显著再激活的患者停止NA后的HBV DNA和HBsAg水平，来研究cccDNA和整合对血清HBsAg（SVP）的相对贡献。这些再激活期间HBV DNA水平的增加并未伴随任何HBsAg的增加，除非HBV DNA达到高于某一阈值水平，推测该水平代表了产生的HBsAg量与整合DNA产生量相等的cccDNA水平。这些病例中的发现表明，cccDNA增加至对应于血清HBV DNA水平约8 log?? IU/mL时，产生的SVP会产生约4 log?? IU/mL的HBsAg水平。这表明在HBV DNA水平为8–9 log IU/mL的样本中，HBsAg水平可能至少部分源自cccDNA。

有趣的是，在停止NA治疗后出现显著再激活的患者中，伴随HBV DNA峰值的HBsAg增加是短暂的，并且HBsAg迅速恢复到停止NA治疗时的水平。这一发现反对在再激活期间积累新的整合，如果大量新的肝细胞被感染，则可能会发生这种情况，并表明整合过程比建议的要慢，或者大多数带有新整合的肝细胞与cccDNA一起被激活的免疫反应清除。

基于先前和本研究中的发现，我们提出SVP与VP比率的增加主要可以通过整合DNA的肝细胞增加和含有cccDNA的肝细胞减少来解释，如补充图1所示。

我们研究的一个局限性是缺乏数据支持S-RNA从cccDNA和整合HBV DNA的转录具有相似速率的假设。我们的解释需要通过比较更多开始抗病毒治疗或停止治疗后强烈再激活的患者的HBV DNA和HBsAg水平来进一步确定。第二阶段下降的特征及其与cccDNA下降的联系可以通过分析治疗期间HBcrAg或HBV RNA的下降来进一步支持。比较使用新抗病毒药物（如siRNA和衣壳抑制剂）治疗期间和治疗后的HBV DNA和HBsAg水平也可能有助于解释不同患者群体中VP和SVP的来源。

总之，我们的研究结果表明，在大多数患者中，cccDNA对HBsAg产生的贡献非常小，并解释了为什么HBsAg是传播风险的不良标志物。尽管如此，维持HBsAg作为HBV感染性的标志物是合理的，因为在未治疗的患者中，HBsAg在某种程度上反映了HBV的复制潜力。