麻疹病毒V蛋白C端结构域自由态溶液结构揭示STAT2靶向机制与宿主互作动态性

本刊推荐：本研究首次通过核磁共振（NMR）解析了麻疹病毒（MeV）V蛋白C端结构域（VCTD）在自由状态下的溶液结构，揭示其独特的锌指构象、顺式脯氨酸异构体及动态柔性区域。该发现阐明了VCTD通过共享结合界面靶向STAT2和MDA5的分子机制，为理解副粘病毒免疫逃逸（如干扰JAK-STAT通路）提供了关键结构基础，对开发新型抗病毒策略具有重要意义。

　　

ABSTRACT

病毒常通过靶向Janus激酶-信号转导与转录激活因子（JAK-STAT）通路的关键组分（如STAT1和STAT2）来逃避宿主抗病毒干扰素（IFN）应答。麻疹病毒（MeV）作为麻疹病毒属成员，编码的多功能V蛋白（MeV-V）可直接与STAT蛋白相互作用。其C端结构域（CTD）选择性结合STAT2，通过抑制STAT2与干扰素调节因子9（IRF9）的结合，破坏IFN刺激基因因子3（ISGF3）复合物的形成。本研究通过核磁共振光谱解析了自由状态下MeV-V_CTD的溶液结构，发现其整体架构（包括独特的锌指模体）与预测一致，但存在意外的特征（如可能具有功能相关性的顺式脯氨酸异构体）。结合弛豫测量和分子映射分析，确定了STAT2识别的关键残基，并揭示了该结构域内的显著构象柔性。这表明MeV-V_CTD使用与黑色素瘤分化相关蛋白5（MDA5）互作相同的结合表面，凸显其结构适应性。鉴于麻疹病毒属V蛋白通过靶向多种蛋白参与多种宿主通路（包括免疫信号、细胞周期调控和凋亡），研究者提出V_CTD的动态且折叠的特性是其作为宿主-病原体互作中多功能相互作用模块的基础。

IMPORTANCE

麻疹病毒V蛋白由P基因编码，通过与多种宿主因子相互作用广泛调节宿主反应（包括免疫逃逸）。尽管副粘病毒5型（PIV5）的V_CTD晶体结构已有报道，但自由状态下该结构域的结构信息仍缺乏，当前认知主要基于结合态结构的计算预测。本研究首次通过NMR提供了副粘病毒V_CTD自由态的结构，并进一步证实STAT2上MeV-V的结合位点与IRF9重叠。观察到的折叠CTD内的构象柔性为其以高特异性结合多个宿主靶标提供了结构基础。

INTRODUCTION

JAK-STAT信号通路是干扰素（IFN）信号的关键介质，常被病原病毒靶向以进行免疫逃逸和调节。病毒因子与JAK-STAT通路组分的相互作用表现出显著多样性，包括从拮抗到刺激效应，涵盖经典（细胞因子和生长因子驱动）和非经典应答。在对抗IFN系统的病毒策略中，干扰STAT1和STAT2（对先天和适应性免疫应答发展至关重要）是被广泛研究的策略之一。

I型（主要为IFN-α/β）和III型（IFN-λ1-4）IFN促进STAT1和STAT2上保守酪氨酸残基的磷酸化，导致STAT1-STAT2异源二聚体形成。该磷酸化（pY）异源二聚体（pY-STAT1–pY-STAT2）与IRF9结合形成称为ISGF3复合物的异源三聚体。核输入后，ISGF3与基因组中的IFN刺激应答元件（ISRE）结合。II型IFN（IFN-γ）促进STAT1的酪氨酸磷酸化，形成pY-STAT1同源二聚体（和/或N端结构域束缚的四聚体），结合DNA中的γ激活序列（GAS）。ISRE和GAS元件共同调节数百个IFN刺激基因（ISG）的转录，协调抗病毒应答。

副粘病毒科的几个病毒编码针对pY-STAT1–pY-STAT2异源二聚体（包括ISGF3）系统的 well-studied 拮抗剂。在该科内，属如麻疹病毒属（如麻疹病毒MeV）、腮腺炎病毒属（如腮腺炎病毒）、亨尼帕病毒属（如尼帕病毒和亨德拉病毒）、呼吸道病毒属（如仙台病毒）和禽病毒属（如新城疫病毒）编码来自P基因的蛋白，包括P、V、W、D、I和C蛋白，它们直接与STAT1和/或STAT2相互作用。

麻疹病毒属包括七个遗传密切相关的物种，其中MeV仍是全球发病和死亡的重要原因。尽管有有效疫苗，MeV每年仍导致多达10万人死亡。MeV基因组是一条约16 kb长的非分段负链RNA。MeV感染诱导深度免疫抑制，增加对继发感染和死亡的易感性。在罕见情况下，MeV在急性感染后在中枢神经系统中持续数年，导致亚急性硬化性全脑炎（一种进行性神经系统疾病）。MeV P基因编码三种蛋白：P、V和C。P蛋白由507个氨基酸残基组成，作为病毒聚合酶（L）的辅因子，而C蛋白由替代起始密码子产生，编码一个不同的186氨基酸蛋白。此外，P的mRNA编辑（插入一个鸟苷）产生一个与MeV-P共享N端231个残基的蛋白（MeV-P_NT = MeV-V_NT），该区域是内在无序的。然而，MeV-P和MeV-V的C端结构域（CTD）完全不同。MeV-V_CTD由68个残基（残基232-299）组成，具有一个锌结合半胱氨酸富集结构域。在副粘病毒中，V_CTD的三维结构已通过副流感病毒5型（PIV5）的V_CTD实验确定。报道了两种PIV5 V_CTD的晶体结构：一种与泛素连接酶DDB1复合，另一种与黑色素瘤分化相关蛋白5（MDA5）的解旋酶结构域复合。鉴于高序列保守性（副粘病毒中约50%同一性），AlphaFold3和其他预测工具表明MeV-V_CTD采用相同的特征性锌指折叠，具有两个锌离子和一个β链基突起。

先前研究广泛表征了MeV-V_NT与STAT1的相互作用，确定氨基酸110-120为STAT1结合的关键区域。相反，MeV-V_CTD显示与STAT2相互作用；特别是Trp240、Phe246、Asp248和Trp250对STAT2结合至关重要。使用纯化的STAT1、STAT2和多种MeV-V构建体（完整、V_NT和V_CT151-299 [残基151-299]），研究者证实MeV-V_NT选择性结合STAT1，而MeV-V_CTD特异性与STAT2相互作用。

除了与STAT1/STAT2的直接相互作用，MeV-V表现出多方面的功能。它参与多种与IFN产生相关的宿主因子，包括磷酸酶PP1、MDA5、遗传学与生理学实验室2（LGP2）、核因子κB（NF-κB）亚基p65、IκB激酶α和IRF7。MeV-V还调节细胞周期和凋亡通路（结合p53和p73），干扰白细胞介素-1β分泌系统（结合NLRP3炎症小体），并通过与5′-氨基乙酰丙酸合酶1（ALAS1）的相互作用破坏线粒体功能，从而影响线粒体动力学。

鉴于预测MeV-V_CTD尽管形成明确的三维结构仍表现出结构灵活性，研究者使用核磁共振（NMR）进行了结构和生物物理表征。本研究确定了自由状态下MeV-V_CTD的溶液结构，揭示了其与靶标复合的PIV5-V_CTD的相似性。与PIV5-V_CTD结构或计算预测的MeV-V_CTD模型相比，在两个脯氨酸肽键的构象以及环构象上观察到显著差异。稳态核奥弗豪泽效应（NOE）分析确定了MeV-V_CTD内的柔性区域。此外，STAT2-core的滴定实验揭示了MeV-V_CTD内 plausible 的新结合位点。竞争实验进一步证明MeV-V_CTD的STAT2结合位点与IRF9-IRF相关结构域（IRF9-IAD）重叠，这与先前报道一致。总之，这些发现表征了自由状态下 well-conserved 副粘病毒V_CTD，并突出了其内在灵活性，这可能有助于其功能多样性。

RESULTS AND DISCUSSION

Preparation of MeV-V_CT221-299 and interaction analysis using isothermal titration calorimetry (ITC)

先前研究者量化了MeV-V（全长）与STAT2、MeV-V与STAT2-core、以及MeV-V_CT151-299与STAT2-core的结合亲和力，证明MeV-V_CT151足以靶向STAT2。本研究设计了一个更短的MeV-V_CT构建体，称为MeV-V_CT221-299（残基221-299），用于NMR光谱分析。尺寸排阻色谱（SEC）的洗脱曲线（纯化过程的最后一步）和SDS-PAGE表明MeV-V_CT221-299的纯度足以进行进一步分析。将纯化的MeV-V_CT221-299与STAT2-core进行ITC相互作用分析。从MeV-V_CT221-299滴定到STAT2-core的实验中，在注射MeV-V_CT221-299过程中观察到典型的放热信号。该滴定曲线很好地拟合了1:1结合模型，从而可以从三个独立实验确定热力学参数。相互作用的解离常数（K_D）在20°C下确定为0.212 ± 0.085 μM，这与10°C下MeV-V与STAT2-core之间的值（0.18 ± 0.1 μM）相当。该相互作用是强烈的焓驱动并遵循1:1化学计量，表明一个MeV-V_CT221-299分子与一个STAT2-core分子相互作用。MeV-V_CT221-299以单体形式存在，进一步支持了这种结合模型。这些结果定义了靶向STAT2所需的最小MeV-V区域。因此，本研究中所有NMR实验均使用MeV-V_CT221-299。

Characterization of MeV-V_CT221-299 by NMR

使用NMR光谱研究溶液中MeV-V_CT221-299的结构特性。为了信号分配，制备了¹³C-、¹⁵N标记的MeV-V_CT221-299，并使用三重共振实验分配了¹⁵N、NH、¹³Cα、¹³Cβ和C′共振。在74个残基中，除Thr262、Ile263、Cys267和Ile289外，¹H–¹⁵N异核多量子相关（HMQC）谱中70个残基的骨架酰胺共振被指认。进一步分析化学位移数据，使用二级结构倾向性（SSP）和随机卷曲指数（RCI）评估二级结构和环区。特定残基计算出的SSP得分为1或-1分别表示完全形成的α-或β-结构。MeV-V_CT221-299的SSP分析显示，残基231-239和245-251的得分在-1.0到-0.5之间，表明β链形成。此外，残基263-275的SSP得分在-0.6到0.1之间，表明部分β链构象。特定残基的RCI得分反映了根据NMR化学位移计算的蛋白质灵活性。MeV-V_CT221-299的RCI分析确定残基221-229和293-299为结构灵活性增加的区域，得分超过0.1。这些发现提供了对MeV-V_CT221-299构象动力学的见解，突出了具有有序二级结构的区域和柔性片段。

Solution structure calculation of MeV-V_CT221-299

使用NOE衍生的距离约束和骨架二面角确定了MeV-V_CT221-299的溶液结构。先前研究表明，通过SEC结合多角度光散射评估，MeV-V和MeV-V_CT151-299在溶液中以单体形式存在。MeV-V_CT221-299的SEC洗脱曲线也证明了其单体状态：根据标准曲线计算的分子量为5.6 kDa（理论质量9.2 kDa）。最终20个能量最小化结构的叠加显示，结构化区域（残基231-279）的骨架原子均方根偏差（RMSD）为0.77 ?，所有重原子为1.26 ?。Ramachandran分析表明，65.6%的残基位于最允许区域，31.9%位于附加允许区域，2.2%位于一般允许区域，0.2%位于不允许区域。预期MeV-V_CTD的核心结构特征包括一个独特的锌指模体，如PIV5-V_CTD的晶体结构和MeV-V的X射线吸收研究所证明。因此，在结构精修中，引入了两个锌离子，由一个组氨酸（残基232）和七个半胱氨酸残基（残基251、255、267、269、272、276和279）配位，这些在副粘病毒V蛋白中都是保守的。最终结构采用特征性的锌指折叠，具有两个锌离子和一个由两个β链组成的β链基突起（残基235-250）。除了两个β链，结构的大部分由长而灵活的环组成。整体折叠类似于与MDA5复合的PIV5-V_CTD、与DDB1复合的PIV5-V、或AlphaFold预测的MeV-V_CT221-299结构。然而，本研究通过稳态¹H–¹⁵N NOE（ssNOE）测量直接观察到了结构灵活性。

使用¹³C_β和¹³Cγ之间的化学位移差异，可以以不依赖参考的方式获得Xaa-Pro肽键构象的信息（Xaa，任何氨基酸残基）。有趣的是，两个脯氨酸残基的¹³C_β和¹³C_γ化学位移差异表明，在自由形式的MeV-V_CT221-299中，Pro253和Pro273主要采用顺式构象（Pro253的C_β为34.65 ppm，C_γ为24.74 ppm，差值为9.91；Pro273的C_β为34.54 ppm，C_γ为24.77 ppm，差值为9.77）。没有观察到这些脯氨酸与反式形式的交换反应。相反，其余三个脯氨酸残基（残基227、295和298；不保守）被指定为反式构象。这两个脯氨酸残基（Pro253和Pro273）在副粘病毒的V蛋白中是保守的。虽然STAT2结合形式的MeV-V_CTD中Pro253和Pro273的构象状态仍未确定，但值得注意的是，在PIV5-V中相应的残基（Pro192和Pro212）在与MDA5和DDB1结合的晶体结构中采用反式构象。尽管需要进一步的实验验证，但在自由MeV-V_CT221-299中观察到的两个顺式构象可能有利于有利的结合反应，可能在与靶分子（如STAT2）相互作用时转变为反式构象。

Titration of STAT2-core on MeV-V_CT221-299 monitored by NMR

为了研究MeV-V_CT221-299与STAT2-core之间的相互作用，进行了通过 band-selective optimized flip-angle short-transient (SOFAST) ¹H–¹⁵N HMQC光谱监测的NMR滴定。由于结合后分子量大幅增加（9.2 kDa [MeV-V_CT221-299] 到 74.9 kDa [MeV-V_CT221-299 和 STAT2-core]），预期¹H–¹⁵N HMQC谱中MeV-V_CT221-299结合位点周围的NMR信号强度会降低，而不是每个化学位移的变化。将¹⁵N标记的MeV-V_CT221-299与STAT2-core以1:0.375、1:0.5、1:0.64和1:1的分子比滴定，导致MeV-V_CT221-299的共振强度逐渐降低。尽管这些数据没有精确定义结合界面，但它们证实了MeV-V_CT221-299与STAT2-core相互作用，与ITC结果一致。值得注意的是，N端（残基221-228）和C端（残基294-299）区域的信号强度相对于其他区域基本保持不变，表明这些末端片段不直接参与相互作用。

Effect of the presence of IRF9-IAD

当加入等摩尔量的IRF9-IAD时，¹⁵N-MeV-V_CT221-299与STAT2-core结合后观察到的¹H–¹⁵N HMQC谱信号强度降低略有恢复。这表明未结合的¹⁵N-MeV-V_CT221-299分数增加。这可以解释为一部分STAT2-core无法与¹⁵N-MeV-V_CT221-299相互作用，因为那部分STAT2-core与添加的IRF9-IAD结合；如果STAT2-core对两个分子（MeV-V_CT221-299和IRF9-IAD）使用相同的结合表面，就会发生这种现象。先前的表面等离子体共振和SEC分析表明，STAT2上MeV-V的结合位点与IRF9-IAD的结合位点重叠。新的NMR结果进一步证实MeV-V与IRF9-IAD竞争STAT2结合。

此外，单独用IRF9-IAD滴定¹⁵N-MeV-V_CT221-299导致¹⁵N-MeV-V_CT221-299的¹H–¹⁵N HMQC谱信号强度降低，表明两个蛋白质之间存在弱相互作用，这是由于出现了与IRF9-IAD复合的¹⁵N-MeV-V_CT221-299。这种弱相互作用在之前的ITC实验中未能观察到。

值得注意的是，当所有三种蛋白质——MeV-V_CT221-299、STAT2-core和IRF9-IAD——以等摩尔量存在时，MeV-V_CT221-299的信号强度恢复，表明STAT2–IRF9-IAD相互作用强于MeV-V_CT221-299–IRF9-IAD相互作用。MeV-V与IRF9-IAD之间的弱相互作用可能影响MeV-V与IRF9对STAT2结合的竞争，可能潜在地影响STAT2靶向的调控机制。

Binding surface is highlighted using the ssNOE experiment

为了获得自由态和STAT2-core结合态之间蛋白质动力学变化的见解，进行了ssNOE测量。显示了¹⁵N-MeV-V_CT221-299在不存在和存在STAT2-core情况下的ssNOE值。在不存在STAT2-core的情况下，MeV-V_CT221-299在整个分子中表现出低的ssNOE值，表明其是高度动态和灵活的结构。当与STAT2-core混合时，残基His232、Ile239、Asn241、Gly242、Asp248和Cys279显示出增加的ssNOE值（超过误差阈值0.2以上），表明相互作用后局部刚性化。结合ITC结果（MeV-V_CT221-299与STAT2-core的相互作用是熵不利的），这表明复合物形成包括结合时的结构刚性化，导致构象灵活性的丧失。

相反，当与STAT2-core混合时，残基Ile236、Trp250、Leu260、Thr268、Thr287、Trp290和His292显示出降低的ssNOE值（降低超过误差阈值0.2），表明STAT2-core结合后获得的灵活性。其中，Trp250令人感兴趣，因为研究者先前报道纯化的MeV-V (W250A) 完全失去了与STAT2的结合活性。如果Trp250直接与STAT2-core相互作用，ssNOE值应在存在STAT2-core时增加。位于β突起底部的Trp250侧链观察到多达33个与中长程（1 < |i-j|）的NOE，稳定了β突起，而不是暴露于溶剂。PIV5-V_CTD中相应的残基Trp189在与MDA5和DDB1的复合结构中扮演相同的角色，不提供与靶分子的直接相互作用。因此，Trp250在MeV-V中可能不是直接用于相互作用，而是有助于保持β突起的结构，这先前被确定为与STAT2相互作用的主要因素。

在人副流感病毒5型（hPIV5）-V_CTD与MDA5复合的晶体结构中，β突起内的β1一侧与MDA5结构域2A的β片层形成延伸的β片层，而另一侧与hPIV5-V_CTD的β2相互作用以进一步稳定β片层。与MDA5的β片层介导的相互作用，以及hPIV5-V_CTD使用Arg172、Glu174和Trp179的侧链特异性贡献，支持了副粘病毒V蛋白中保守的结合模式，鉴于序列同源性。因此，也预期MeV-V_CTD与MDA5之间存在类似的相互作用。比较了MeV-V_CT221-299的自由态结构（本研究）与hPIV5-V_CTD的结构，指出了与各自靶标相互作用的重要残基。在MeV-V_CT221-299的结构中，研究者提出直接相互作用的关键残基分布在β突起上，并且STAT2的结合位点与MDA5的结合位点重叠。

由于IRF9-IAD结合在STAT2的卷曲螺旋结构域（CCD），并且MeV-V与IRF9-IAD竞争相同的结合位点，也可以预测MeV-V_CT221-299靶向STAT2的CCD。ssNOE数据表明MeV-V_CT221-299使用类似的界面来识别STAT2和MDA5。值得注意的是，副粘病毒V_CTD已知通过接合多个宿主靶标来促进免疫逃逸。尽管这些结构域采用独特的三维折叠，但它们固有的灵活性可能使其能够使用相同的结合位点识别多样的靶分子，类似于内在无序蛋白，它们在结合不同伙伴时发生结构适应。对MeV-V靶向（如STAT2和MDA5）分子基础的更深入理解可能有助于开发新的抗病毒策略，包括MeV-V抑制剂或更安全的疫苗株。

MATERIALS AND METHODS

Construction of the expression plasmid of recombinant MeV-V_CT221-299

为了生成MeV-V_CT221-299表达载体，通过PCR在人鼻病毒3C蛋白酶（HRV-3C）切割位点引入到MeV-V_CT151-299的Arg220和Ala221之间（在pGEX-6P-2载体中）。使用引物5′-TTTCAGGGCCCGGCCAGCACTTCCGAGACACC-3′和5′-CAGCACTTCCAGCCTACTGGGGTTCGGGGG-3′。随后通过PCR使用引物5′-CCCCTGGGATCCCCAGG-3′和5′-AACTTCCAGATCCGATTTTGGAGG-3′移除GST标签后的预先存在的HRV-3C切割位点。使用Applied Biosystems 3130 Genetic Analyzer对PCR产物进行测序。3C蛋白酶消化后得到的MeV-V_CT221-299被设计为在Ala221之前包含额外的Gly和Pro。

Expression and purification of recombinant proteins

为了表达MeV-V_CT221-299，使用表达载体转化大肠杆菌BL21 star (DE3)菌株。将转化体的单菌落接种到5 mL LB培养基（含100 μg/mL氨苄青霉素）中，在37°C、150 rpm振荡培养。然后将5 mL预培养物接种到2 L带挡板烧瓶中的1 L LB培养基中，并在150 rpm、37°C振荡。当培养物光密度（OD600）达到0.6时，加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG，终浓度1 mM），随后在16°C培养16小时。最后通过离心收获细胞。

将细胞重悬于细胞裂解缓冲液A [磷酸盐缓冲盐水（PBS），pH 7.3，1 mM二硫苏糖醇（DTT），DNase I，鸡卵溶菌酶]至终浓度0.2 mg/mL，并使用超声仪破碎。将细胞溶液在10°C、40,000 × g离心30分钟，收集上清液。过滤后，将谷胱甘肽琼脂糖4B加入可溶部分中，并重悬过夜。用缓冲液A洗涤后，使用His标记的3C蛋白酶在5 mM DTT存在下从树脂上洗脱MeV-V_CT221-299。使洗脱液通过HisTrap HP柱以去除蛋白酶。然后通过疏水相互作用色谱（HIC）使用HiTrap Butyl FF柱进一步纯化蛋白质，使用HIC结合缓冲液 [10 mM HEPES, pH 6.8, 150 mM NaCl, 1.2 M硫酸铵, 1 mM Tris(2-羧乙基)膦（TCEP