基于mNGS、PCR与传统方法的层级整合策略：推动结核病精准诊断的新范式

本综述系统评估了七种结核病（TB）检测方法（包括mNGS、ddPCR、RT-qPCR、EasyNAT、Xpert MTB/RIF、IGRA和AFS）的诊断效能，首次在单中心队列中综合比较其敏感性、特异性与经济性，并提出基于医疗资源分级的层级化诊断方案，为优化全球结核病精准诊疗提供实践性策略。

　　

摘要

本研究系统性比较了七种检测结核分枝杆菌复合群（Mycobacterium tuberculosis complex, MTBC）方法的诊断准确性，包括宏基因组下一代测序（metagenomic next-generation sequencing, mNGS）、微滴数字聚合酶链反应（droplet digital polymerase chain reaction, ddPCR）、实时定量聚合酶链反应（real-time quantitative polymerase chain reaction, RT-qPCR）、EasyNAT MTC、GeneXpert MTB/RIF（Xpert）、γ-干扰素释放试验（interferon-gamma release assay, IGRA）和抗酸染色（acid?fast staining, AFS）。研究旨在依据敏感性、成本效益和操作可行性，为不同医疗资源水平的地区选择合适的结核病（TB）检测组合方案。

回顾性分析收集了2022年4月至2024年4月期间中山大学附属第一医院疑似活动性结核患者的141份样本，其中100例归入病例组，41例归入对照组。收集了Xpert、IGRA和AFS的历史数据，并对所有样本并行进行了mNGS、ddPCR、RT-qPCR和EasyNAT实验。通过与最终临床诊断的比较，评估了各方法的诊断性能，进行了敏感性、特异性、阳性预测值、阴性预测值和受试者操作特征（receiver operating characteristic, ROC）曲线分析，并采用DeLong检验进行统计学比较。

结果显示，与最终临床诊断相比，mNGS的敏感性最高（100%），其后依次为IGRA（79.2%）、EasyNAT（79.1%）、RT-qPCR（78.0%）、ddPCR（75.8%）、Xpert（75.3%）和AFS（16.7%）。特异性方面，Xpert和AFS均为100%，其后是ddPCR（97.6%）、RT-qPCR（95.1%）、EasyNAT（92.7%）、IGRA（72.7%）和mNGS（75.6%）。ROC分析显示，mNGS的曲线下面积（area under the ROC curve, AUC）为0.878，显著高于ddPCR（0.817，P = 0.031）。DeLong检验显示，mNGS与ddPCR之间（P < 0.05）以及IGRA与AFS之间（P < 0.01）的诊断性能存在统计学显著差异。mNGS能够独特地识别混合感染中的病原体，并对病原体特异性测序读段进行定量。

通过全面评估结核病检测方法的诊断效能、成本效益和时效性，本研究为不同医疗资源水平的地区提出了相应的结核病检测策略组合。对于资源有限的欠发达地区，推荐AFS + EasyNAT + 胸部X射线组合；基层医疗机构可增加使用IGRA + RT-qPCR；中级医院可引入Xpert MTB/RIF进行耐药性检测；而三级医院或专科中心则应在这些基础检测之上，利用mNGS进行诊断，并采用ddPCR对复杂混合感染患者进行疗效监测。

引言

结核病（Tuberculosis, TB）是由结核分枝杆菌复合群（MTBC）引起的重大全球健康挑战，2024年全球发病病例估计为1080万（95%不确定区间：1010万–1170万），且对低收入和中等收入国家的影响尤为严重。肺结核（Pulmonary tuberculosis, PTB）约占活动性病例的90%。肺结核的进展隐匿且临床表现非特异性，导致准确诊断和及时干预的延迟。中国在全球结核病负担中排名第三，贫困地区医疗资源匮乏和社会经济差异加剧了疾病传播，使诊断面临更大挑战。

传统的实验室方法，包括抗酸染色（AFS）和分枝杆菌培养，仍然是基础手段，但由于成本高和基础设施要求高，其在农村和资源有限地区的应用至关重要。AFS的敏感性较低（15%–40%），假阴性率高，而培养鉴定需要2–6周的时间，不适合急性临床决策。γ-干扰素释放试验（IGRA）检测MTBC特异性免疫反应，但无法准确区分潜伏感染和活动性疾病。这些缺点凸显了对快速、精确诊断替代方法的迫切需求。

核酸扩增检测技术革命了结核病诊断。实时定量聚合酶链反应（RT-qPCR）结合TaqMan荧光探针定量技术检测结核病，具有高特异性、重复性好和操作简单的特点。Xpert MTB/RIF（Xpert） assay（Cepheid, Sunnyvale, CA, USA）被世界卫生组织（WHO）推荐为一线检测方法，可在2小时内同时进行MTBC检测和利福平耐药性筛查。然而，其在涂片阴性样本中的敏感性下降至67%。EasyNAT MTC assay（USTAR Biotechnologies, Hangzhou, China）是一种基于环介导等温扩增的结核病分子检测方法，被推荐用于初级保健机构中活动性肺结核的诊断，并列入WHO首份基本体外诊断清单。它以较低的成本和不到2小时的处理时间提供相当的敏感性，适合资源有限地区。

宏基因组下一代测序（mNGS）提供不依赖培养的无偏病原体检测，能够早期识别MTBC和混合感染中的病原体。通常，当MTBC读段数达到甚至超过报告阈值（低至一个读段）时，即视为阳性报告。尽管具有诊断前景，mNGS面临一些挑战，包括较长的周转时间（通常24–48小时）、生物信息学复杂性以及难以区分真阳性与污染或分析伪影。此外，mNGS在诊断中的最重要限制是尚未成为一线诊断 assay，且无关生物的检测可能引起医生困惑。

近年来，微滴数字PCR（ddPCR）因其无与伦比的敏感性和精确性被开发并用于肺结核检测。即使对于低浓度样本中的痕量DNA，ddPCR仍具有高准确性。以Targeting One微滴数字PCR系统为例，设计引物对检测MTBC的插入序列（IS）6110和1081的保守区域。单个拷贝在任何微滴中即为阳性，实现近乎绝对的特异性。尽管前景广阔，ddPCR与已建立 assay 的综合性能数据仍缺乏。

本研究通过单中心研究，评估了疑似肺结核感染患者的七种诊断方法——AFS、IGRA、Xpert、EasyNAT、mNGS、RT-qPCR和ddPCR，旨在根据敏感性、成本效益和操作可行性，为不同医疗资源水平的地区选择合适的结核病检测组合方案。

材料与方法

研究设计与参与者

2022年3月至2024年4月期间，中山大学附属第一医院共纳入139例疑似结核感染患者的141份样本。纳入标准包括：（i）临床症状持续≥2周（如 productive cough、 prolonged fever、 night sweats、 unexplained weight loss）；（ii）影像学异常符合结核病（如 cavitary lesions、 nodular infiltrates）；（iii）年龄≥5岁以确保 adequate sputum 和/或 bronchoalveolar lavage fluid (BALF) 样本采集。样本立即处理或储存于?80°C供后续分析。初始队列中的61例患者因诊断数据不完整（如缺失 assay 结果）、非合规样本或样本降解而被排除。

AFS、IGRA和Xpert的诊断结果从实验室信息系统中回顾性检索。对可用样本前瞻性进行了mNGS、EasyNAT MTC、RT-qPCR和ddPCR。最终结核病诊断由传染病和呼吸专科 multidisciplinary panel 根据以下标准确定：（i）胸部影像显示活动性MTBC病变，伴（a）可疑症状、（b）中度及以上阳性结核菌素试验、（c）阳性IGRA测试、（d）阳性结核抗体、（e）肺外组织病理变化、（f）支气管镜检查符合活动性MTBC；（ii）两次痰涂片AFS阳性或一次痰涂片AFS阳性伴影像学证据或培养确认MTBC；（iii）培养确认MTBC伴影像学证据；（iv）分子生物学确认伴影像学证据；（v）肺组织病理变化。系统记录了所有纳入患者的人口统计学数据（年龄和性别）和样本类型。

样本处理

对于非粘稠BALF样本，轻轻匀浆后直接转移1 mL至1.5 mL微量离心管。对于粘稠BALF样本或痰液，向含0.2–0.3 mL样本的1.5 mL离心管中添加消化液，通过20次抽吸循环机械 disruption，剧烈涡旋（≥10次垂直摇晃循环），然后在37°C热块中孵育3分钟，间歇 agitation。之后，样本短暂离心，转移1 mL完全液化样本至新鲜1.5 mL离心管。对于静脉血，样本在1,600 × g离心10分钟，从 supernatant 吸取0.3 mL血浆部分。对于脑脊液（CSF）或含保存液的气管分泌物，轻轻涡旋混合后，精确转移0.6 mL至1.5 mL微量离心管。对于其他样本如胸水、引流或灌注液、腹膜透析液，样本在1,600 × g离心10分钟；小心弃去大量 supernatant；用剩余5 mL supernatant 重悬沉淀细胞。然后，吸取1 mL至1.5 mL离心管，在12,000 × g离心5分钟；弃去0.9 mL supernatant；留0.1 mL沉淀供后续使用。

mNGS

所有样本在核酸提取前需进行宿主去除。按照制造商操作手册，使用IDseq Micro DNA Kit（Visual Medicine, Guangzhou, China）提取DNA。除EasyNAT需直接使用处理后的原始样本外，所有其他方法的DNA提取均遵循mNGS的提取流程。通过转座酶法构建DNA文库。纯化和大小选择后，使用Qubit仪器检测文库浓度后再上机。文库随后在Illumina Next Seq 550系统上使用75 bp单端测序试剂盒（Illumina, California, USA）进行测序。合格数据要求每个样本获得不少于1000万读段，且Q30分数≥85%。每次测序中，阴性对照 parallel processing 和测序以进行质量控制。检测到一条特异性结核分枝杆菌序列即可判定阳性。

RT-qPCR

使用结核分枝杆菌复合群核酸检测试剂盒（PCR-荧光探针法）（Daan Gene, Guangzhou, China）提供RT-qPCR所需试剂。通过在Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System（USA）上进行等温扩增，获得每个样本的循环阈值（CT），定义CT值≤38为阳性报告。注意，测试需包括阴性和阳性对照。

EasyNAT

使用结核分枝杆菌复合群核酸检测试剂盒（等温扩增-实时荧光法）（USTAR Biotechnologies）检测基因组DNA的IS 6110区域。提取液充分混合至无沉淀，转移至内标管。然后充分混合10–20秒。上述混合物与样本混合后转移至检测管。拧紧管盖，将管置于自动集成核酸扩增检测分析仪（USTAR Biotechnologies）上。分析仪可自动报告阳性结果（MTC Tt ≤40）或阴性结果（MTC Tt >40）。如因操作不当等原因分析仪显示无效结果，样本需重测。

ddPCR

按照先前描述的方法，使用Targeting One微滴数字PCR系统进行ddPCR。将30 μL反应混合物和180 μL油通过Targeting One Drop Maker M1（Targeting One, Beijing, China）生成乳液微滴。PCR扩增后，将微滴加载到Chip Reader R1（Targeting One）上，并通过Targeting One分析软件（Targeting One）扫描分析每个微滴。最后，分析每个样本的IS1081的FAM（488 nm激光）荧光强度和IS6110的VIC（532 nm激光）荧光强度。使用阳性和阴性对照确定选择阳性微滴的荧光阈值水平。当IS6110或IS1081基因每反应至少3个拷贝阳性时，确认MTBC感染。

统计分析

使用SPSS 26.0软件进行统计分析。正态分布的连续数据描述为均值±标准差，非正态分布的连续数据描述为中位数（四分位距）。分类变量以例数（n）和百分比（%）表示，并通过卡方检验分析。使用受试者操作特征（ROC）分析和DeLong检验评估不同方法的诊断效能。

结果

参与者基线特征

共纳入139例疑似结核感染患者的141份样本。总体而言，100份样本来自临床确诊患者。患者基线特征如表1所示。结核感染患者的平均年龄为56.7岁，其中68例（68%）为男性。非结核组平均年龄为56.6岁，31例（75.6%）患者为男性。年龄或性别无统计学显著差异。样本类型在结核组中多为BALF（81, 81%），其后依次为静脉血（6, 6.0%）、CSF（1, 1%）、痰液（1, 1%）、气管分泌物（2, 2%）和其他（9, 9%）。非结核组全部为BALF样本。

mNGS、ddPCR、RT-qPCR、EasyNAT、Xpert、IGRA和AFS在结核检测中的性能

与医生确定的最终临床诊断相比，我们评估了mNGS、ddPCR、RT-qPCR、EasyNAT、Xpert、IGRA和AFS在结核检测中的性能，并评估了每种测试的敏感性和特异性。如表2所示，mNGS、ddPCR、RT-qPCR、EasyNAT、Xpert、IGRA和AFS对于结核检测的敏感性分别为100.0%、75.8%、78.0%、79.1%、75.3%、79.2%和16.7%，特异性分别为75.6%、97.6%、95.1%、92.7%、100.0%、72.7%和100.0%。阳性预测值分别为90.9%、98.7%、97.5%、96.0%、100.0%、87.1%和100.0%，而阴性预测值（NPV）分别为100.0%、62.5%、63.9%、66.7%、57.1%、60.0%和27.1%。mNGS的特异性为75.6%（41例中有31例），识别出10例假阳性病例。

还生成了ROC曲线，如图2和表3所示。受试者操作特征曲线下面积（AUC）分别为0.878、0.867、0.871、0.859、0.924、0.760和0.583（图2A）。当保留完整数据时（n = 72；55份阳性样本和17份阴性样本），AUC（表示为AUC*）分别为0.971、0.882、0.900、0.891、0.918、0.712和0.564（图2B）。使用DeLong检验确定AUC的显著性（表4）。毫无疑问，mNGS显示出最佳的诊断准确性。mNGS与ddPCR之间存在差异。ddPCR、RT-qPCR、EasyNAT和Xpert之间的差异无统计学显著性。

mNGS中混合感染病原体的识别

mNGS的主要优势在于其能够在一个 assay 中全面检测混合感染中的病原体，同时提供定量序列读段数据（图3和4）。我们的分析确定了结核患者中的九种流行病原体，如图3所示。病毒混合感染率很高，主要涉及 Epstein-Barr virus（20/100）、 human herpes virus（17/100）和 Torque teno virus（11/100）。这些病毒流行率高，也存在于健康个体中。真菌病原体主要是 Candida albicans（18/100）和 Aspergillus fumigatus（6/100），常见于免疫受损患者。此外，细菌混合感染包括革兰阳性球菌如 Staphylococcus aureus（9/100）和革兰阴性杆菌如 Klebsiella pneumoniae（5/100），两者均常与医院获得性感染相关。MTBC序列呈现明显的右偏分布，大多数样本（频率峰值）聚集在较高读段数区间（图4）。检测下限（读段）证明了mNGS识别低丰度分类群的能力，尽管此类发现的临床相关性需要进一步验证。

本地医院各方法的时间和成本

我们汇总了mNGS、ddPCR、RT-qPCR、EasyNAT、Xpert、IGRA和AFS用于结核检测的结果报告成本和时间，如表5所示。EasyNAT、Xpert和AFS的报告时间在2小时内，比RT-qPCR（4小时）、IGRA（24小时）、mNGS和ddPCR（24–48小时）更快，因为样本预处理简单且操作容易。AFS的成本最低，其次是RT-qPCR和EasyNAT、ddPCR、IGRA、Xpert和mNGS。由于ddPCR尚未大规模投入临床使用，我们仅提供了参考价格。

讨论

结核病仍然是全球单一传染源导致死亡的首要原因，全球约四分之一人口（约20亿人）对MTBC表现出免疫反应，但无临床、微生物学或放射学证据，这种情况称为潜伏结核感染（latent tuberculosis infection, LTBI），具有终身再激活风险，导致5%–10%的病例发展为结核病。WHO提倡使用IGRA诊断LTBI，因为其在卡介苗接种人群中的高特异性。然而，我们的研究显示IGRA性能欠佳（敏感性：79.2%，特异性：72.7%，NPV：60%），尤其在围产期结核病例中，凸显了在临床工作流程中补充诊断方法如胸部X射线和分子 assay 的必要性。

尽管成本低且操作简单，AFS敏感性差（特异性：100%），不足以作为独立测试。当患者有结核感染史、非结核分枝杆菌感染或诺卡氏菌感染时，AFS可能产生假阳性结果。2021年在中国17家指定结核病医院进行的全国性调查显示，抗酸杆菌涂片阳性患者中非结核分枝杆菌（NTM）的比例为6.8%。此外，NTM感染的高危人群主要包括实体器官移植受者和异基因造血干细胞移植受者。然而，由于NTM发病率低和随机化因素，本研究未纳入NTM病例，这导致了相对较高的特异性。

培养方法虽然是确定性的，但周转时间长（2–6周）。鉴于传统细菌学检测方法的众多缺点，WHO于2025年修订了结核病诊断标准，将分子生物学检测阳性结果患者纳入病因学确认病例类别。本研究旨在通过全面评估我们实验室现有结核检测平台的诊断性能和卫生经济学，为不同场景下的快速结核检测提供不同的测试方案。

通过交叉引物扩增，EasyNAT提供快速（<2小时）、低成本的测试，且试剂可室温保存。然而，在实际测试中，与其他方法相比，EasyNAT目前更容易因内标检测异常而需要重测。基于AUC和DeLong检验结果，EasyNAT和RT-qPCR表现出与mNGS、Xpert和ddPCR相当的诊断效能，阴性预测值分别为66.7%和63.9%，高于Xpert（57.1%）。EasyNAT在排除诊断方面显示出潜力。

Xpert MTB/RIF可在2小时内同时进行MTBC检测和利福平耐药性筛查，在涂片阴性痰液中敏感性提高（78.9% vs 66.1%）。虽然它具有最高的特异性和阳性预测值，但其应用受限于高成本、有限的肺外结核检测和基础设施要求。因此，它最适合结核病高发病率和负担的地区，以及具有中级及以上运营能力的实验室。

本研究验证了ddPCR在靶向MTBC保守序列（IS6110/IS1081）中的效能，检测限低至单拷贝DNA。与RT-qPCR相比，ddPCR在涂片阴性肺结核和肺外结核病例的低浓度样本中表现出更好的一致性（κ = 0.82）。此外，研究表明ddPCR在胸水中的敏感性为90.5%，在石蜡包埋组织中为98.5%。此外，ddPCR对抑制剂具有抵抗力，这为监测亚临床感染和通过动态跟踪细菌DNA负载变化评估治疗效果铺平了道路。ddPCR的关键优势包括高敏感性、绝对定量能力、强抗干扰能力以及适用于多样本类型（如血液和淋巴组织）。然而，其缺点也很显著，包括设备和试剂成本高、操作复杂耗时、检测通量低以及强烈依赖熟练技术人员。在本研究中，ddPCR在各个方面表现出高性能优势。总体而言，当前的ddPCR方法在肿瘤学和传染病中有众多应用，并且仍在持续发展中。然而，由于相对较高的成本和长周转时间，它在结核感染领域尚未广泛应用。由于其优异的综合诊断性能，ddPCR有望在未来在医疗资源丰富的地区或实验室得到更广泛的应用。

在本研究中，mNGS表现出极高的敏感性（100%）和阴性预测值（100%）。尽管可能受样本量、样本选择偏倚和假阳性导致敏感性虚高等因素影响，mNGS与其他方法相比仍具有最高的诊断性能，AUC为0.971。mNGS的无偏检测能力，能够同时识别MTBC、非结核分枝杆菌和混合感染中的各种病原体（如病毒、真菌和其他细菌病原体），对免疫受损人群的治疗策略产生关键影响。实验室可在24?72小时内提供mNGS结果，从而加快临床决策，有助于制定更精确和有针对性的治疗方法。此外，mNGS对多样本类型（如结核性胸膜炎、结核性脑膜炎和脊柱结核）具有显著诊断优势。然而，其局限性包括成本高，限制了在经济欠发达地区的应用，以及环境或操作污染导致假阳性的风险，可能导致误诊及其相对较低的特异性（75.6%）和在低读段情况下的易假阳性性和生物信息学依赖性。在本研究中，所有mNGS发现必须在临床背景（呈现症状、流行病学、宿主免疫状态和影像学发现）内严格解释。假阳性病例可通过针对性验证测试（如结核分枝杆菌复合群特异性PCR assay、ddPCR或IGRA）进行验证，有效防止仅基于mNGS结果启动不必要的抗菌治疗或不适当的侵入性诊断程序。

既然我们了解了这七种方法的优缺点，贫困地区拥有所有七种方法的可行性如何？贫困（以低GDP为特征）与较高的结核病发病率显著相关，间接凸显了经济弱势地区在检测、预防和医疗可及性方面的挑战。中国西部和中部的 distinct trends 进一步表明，贫困和资源分配不公可能加剧结核病传播和诊断不足风险。需要有针对性的干预措施来解决医疗基础设施和公平资源分配方面的差距。

WHO的终结结核病战略强调公平获得快速诊断是全球消除努力的基石。然而， stark disparities 依然存在：贫困地区往往缺乏Xpert MTB/RIF或mNGS等分子 assay 的基础设施，而对AFS的过度依赖 perpetuates underdiagnosis。我们的研究通过分层诊断算法突出了可操作的解决方案。在资源有限的欠发达地区，AFS + EasyNAT + 胸部X射线组合提供了一种务实的方法。EasyNAT的低成本（mNGS的1/35）、室温稳定试剂和最低技术要求使其成为即时检测的理想选择，减轻了非结核分枝杆菌感染和诺卡氏菌的假阳性。与需要专门PCR实验室进行测试的RT-qPCR相比，EasyNAT作为一种即时检测设备，仪器相对便携，试剂可室温储存，测试时间短，且测试后污染风险低。此外，EasyNAT的测试成本仅为mNGS的1/35。

对于初级卫生保健机构（如社区和乡镇医院），IGRA + RT-qPCR组合可以利用中国不断增长的初级实验室基础设施和下降的IGRA成本；IGRA与AFS和常规分子测试（如RT-qPCR或EasyNAT）结合，可用于初级卫生保健级别的普通人群筛查。

将Xpert MTB/RIF纳入常规工作流程为中级资源实验室（如县级医院和二级医院）提供耐药性筛查的快速解决方案。在这些基础测试之上，三级医院或专科中心可以采用mNGS诊断复杂混合感染患者，并利用ddPCR进行疗效监测。此外，ddPCR有助于确认低序列mNGS结果以减轻过度诊断。

尽管本研究推进了结核病诊断，但仍存在局限性，如样本量限制和某些检测数据缺失。此外，纳入结核病耐药性研究将是有益的。靶向下一代测序（targeted next-generation sequencing, tNGS）表现出高敏感性和特异性，成本更低，检测更快，且不受宿主核酸干扰影响。它目前也广泛应用于结核病诊断领域，但本研究未包括。由于我们实验室较晚启动tNGS测试，剩余样本量不足以进行补充测试。我们将在未来研究中纳入相关比较分析。未来，努力应集中在人工智能驱动的生物信息学流程上，以提高mNGS的特异性，减少周转时间，并进行多中心验证以优化不同医疗生态系统中的成本效益比。

通过全面评估结核病检测方法的诊断效能、成本效益和时效性，我们为不同医疗资源水平的地区提出了相应的结核病检测策略组合。对于资源有限的欠发达地区，推荐AFS + EasyNAT + 胸部X射线组合；基层医疗机构可增加使用IGRA + RT-qPCR；中级医院可引入Xpert MTB/RIF进行耐药性检测；而三级医院或专科中心则应在这些基础检测之上，利用mNGS进行诊断，并采用ddPCR对复杂混合感染患者进行疗效监测（图5）。该策略旨在加速消除结核病。

结论

基于针对不同资源水平地区的定制组合测试策略，结核病控制的未来取决于它们的广泛实施和持续改进。我们期望加快开发并使创新诊断技术更易获得，如更敏感和快速的分子诊断以及人工智能辅助解释，将进一步提高诊断的准确性和效率，尤其为资源有限地区带来益处。同时，深化全球合作和知识共享，确保最具成本效益策略的大规模应用和动态调整，将成为弥合早期结核病检测最后差距并最终实现全球结核病消除目标的核心驱动力。

致谢

本研究得到三个不同来源项目的支持：广东省基础与应用基础研究基金（2023A1515012526和2024A1515012332）、广州市临床高技术、重大和特殊技术项目（2023P-TS46）以及广东省疾病预防控制中心人才支持项目（0720240122）。

P.C.监督研究并审阅草稿。L.A.和S.A.设计研究并分析和解释患者数据。Y.Z.和L.D.进行微滴数字PCR检查，是撰写手稿的主要贡献者。J.S.负责统计分析和图形呈现。W.S.负责样本收集。Y.C.和X.Y.进行宏基因组下一代测序（mNGS）。H.H.和G.H.负责整理和分析mNGS结果。E.H.和N.W.进行EasyNAT和RT-PCR。所有作者阅读并批准最终手稿。