Rad54与Hed1介导的有丝分裂向减数分裂重组转变过程中Rad51调控的结构基础

本研究发现Rad54和Hed1通过结合Rad51-ssDNA核蛋白纤维的相同表面裂隙，以完全相反的取向和不同的分子机制实现对Rad51活性的双向调控。该研究通过冷冻电镜技术解析了Rad54的FxxP基序与Hed1特有基序分别与Rad51复合物的高分辨率结构，揭示了减数分裂中同源染色体特异性重组（HR）的分子开关机制，为癌症（cancers）及基因组不稳定相关疾病提供了重要结构药理学靶点。

　　

Significance

Rad51是通过同源重组（HR）修复断裂DNA的关键蛋白，该过程需精确调控以确保在正确时空条件下进行。在有丝分裂中，Rad54蛋白协助Rad51行使功能；而在减数分裂中，Hed1蛋白通过抑制Rad51使其失活，从而让减数分裂特异性重组酶Dmc1接管DNA修复任务。尽管这些蛋白质的协同机制尚未完全阐明，本研究通过冷冻电镜技术解析了Rad54与Hed1分别结合Rad51的结构，阐明了Rad54在有丝分裂中辅助Rad51的机制，以及Hed1在减数分裂中阻断Rad51并促使Dmc1发挥功能的分子基础。

Abstract

Rad51催化同源重组过程中的DNA配对反应，而该过程必须受到严格调控以确保生理学上适宜的结果。Rad54是一种ATP依赖性DNA马达蛋白，在有丝分裂中刺激Rad51活性。在减数分裂中，Rad51被Hed1下调，后者通过阻断Rad54与Rad51的结合，使得Dmc1成为主要活性重组酶。目前关于Rad54、Hed1、Rad51和Dmc1之间的调控相互作用机制了解甚少。本研究识别出Rad54中一个保守的Rad51相互作用基序，并解析了该基序与Rad51结合的冷冻电镜结构；同时鉴定出Hed1中一个独特的Rad51相互作用基序并解析其与Rad51的复合物结构。这些结构揭示了Rad54如何结合Rad51以促进有丝分裂中姐妹染色单体之间的重组，以及Hed1如何在进入减数分裂时抑制Rad51，从而使其减数分裂特异性同源物Dmc1能够促进同源染色体之间的重组。

Rad54与Rad51的预测相互作用

尽管已有关于Rad54核心Snf2马达域晶体结构的报道，但其与Rad51-ssDNA预合成复合物结合的结构尚未获得。通过生物信息学分析与AlphaFold3建模，研究发现Rad54的N端结构域（NTD）内存在一个保守区域（氨基酸101–144），其中包含一个在所有真核生物中保守的FxxP基序。预测表明，该区域在与Rad51结合时呈现高度结构化状态，并能与Rad51-ssDNA核蛋白纤维相互作用。因此，将Saccharomyces cerevisiae Rad54的T101–L144段暂定为潜在的Rad51相互作用基序。

Rad54结合预合成复合物的结构

研究获得了S. cerevisiae Rad51与96核苷酸ssDNA片段在ATP存在下、并结合Rad54（T101–L144肽段）的3.3?冷冻电镜结构。该肽段位于核蛋白纤维的外表面，与ssDNA相对。每个Rad54肽段与纤维中两个相邻的Rad51原体结合，埋藏表面积达1651.4?2。该肽包含N端环（R103–A110）、短螺旋（Q111–D116）、另一短螺旋（P117–T126）以及含FxxP基序的C端环区（L127–K136）。其主要通过疏水作用和静电作用与Rad51结合，其中L113、L120、L127和I123与Rad51的V140–V145疏水口袋相互作用，FxxP基序则与G209–G213疏水区结合。碱性残基K105、R112、R119、R128和R129与Rad51的E212、E156、D149、E271和N246形成静电网络。

Rad51保守突出酸性斑块的分析

先前有假说认为Rad51表面由D239、D241和D242组成的保守突出酸性斑块（PAP）参与和Rad54的相互作用。然而结构显示，D241背向结合肽段，D239与D242距离Rad54碱性残基过远，无法形成强静电作用。遗传学实验表明，单个或双点突变体在甲基甲磺酸（MMS）耐受性方面表现正常，而三突变体（D239A/D241A/D242A）则出现功能缺失表型，但体外实验显示其仍支持Rad54依赖性D环形成，提示该突变可能影响蛋白稳定性或与其他因子（如Rad55-Rad57或Rad52）的互作而非特异性干扰Rad54结合。

Rad54的Rad51相互作用基序的遗传学分析

通过定点突变评估Rad54与Rad51界面残基的重要性。多数单点突变对细胞在MMS中的存活影响不大，但L127A、L127D和F131A则导致明显缺陷。L127参与疏水作用，F131是FxxP基序的关键残基。多重突变体（如K105D/R112D/R119D、R128D/R129D/K136D和R129A/V133A/I135A）均导致严重表型缺陷，表明这些残基在功能上的协同性。

Rad54的Rad51相互作用基序的深度突变扫描

通过深度突变扫描系统性评估Rad51相互作用基序中每个残基的功能重要性。除FxxP基序外，该区域对单点突变普遍具有较高耐受性。L127A和L127D分别呈现9倍和1679倍的功能缺陷，而P134A（FxxP中的脯氨酸）突变则被耐受，与点突变结果一致。进化保守性与深度突变数据高度吻合，表明FxxP中的苯丙氨酸和脯氨酸是Rad54与Rad51互作中最关键的残基。

Hed1与Rad51复合物的预测结构

Hed1是减数分裂特异性小蛋白，通过阻断Rad54与Rad51的结合而下调Rad51活性。生物信息学与AlphaFold3预测表明，Hed1的C端区域（118–156）在与Rad51结合时呈现结构化，其结合位点与Rad54重叠但序列完全不同，且不包含FxxP基序，提示其可能采用独特的结合机制。

Hed1结合的Rad51预合成复合物结构

研究解析了Hed1（P118–P156肽段）与Rad51-ssDNA复合物的2.8?冷冻电镜结构。该肽段以相反于Rad54的取向结合相同Rad51表面裂隙，埋藏表面积为1494.4?2，并可稳定Rad51纤维。其结构包含N端环（P118–S123）、三匝α螺旋（L124–F135）和C端环（Y136–P156）。主要互作包括：K122、T131、T134、Y136与Rad51的E271、Q267、H257形成氢键；L124与A248疏水作用；K125、I128、N132与第二Rad51原体的D149、F144/V145及F144主链原子相互作用；C端环通过Q137、K146、K152与R138、E108、E156产生静电作用，并通过V138、V143、Y145、L149与Rad51的A137、V140、P141、M142、G143、F144、G318、V319、A320疏水口袋结合。已知Hed1突变体I128M、T131P、N132S/N132I均破坏与Rad51的互作，与结构观察一致。

Hed1的Rad51相互作用基序的遗传学分析

通过在体实验验证Hed1与Rad51互作界面的生物学相关性。利用Hed1在有丝分裂中表达可抑制Rad51修复功能的现象，测试点突变体对MMS敏感性的影响。大多数参与互作的单点突变（如K122A、L124A、K125A、T131A、Y136A、V138A、V143A、K146A、L149A、K152A）均导致Hed1功能丧失，而T134A表型正常，Q137A部分失活。所有多重突变体均呈现无效表型，支持结构的生物学相关性。

讨论

Rad54与Rad51预合成复合物的相互作用

Rad54以1:1化学计量比结合Rad51纤维，其结合位点横跨两个相邻原体，既可解释其对预合成复合物的稳定作用，也阐明了Rad54仅在Rad51纤维组装后才被招募至DNA损伤位点的时序调控机制。此外，Rad54的NTD还包含调控分支DNA底物偏好的DNA结合决定簇，其大部分序列在物种间不保守，为不同生物中Rad54功能的特异性适应提供了演化空间。

Rad51-Rad54结合机制的保守性

Rad54的FxxP基序及其在Rad51上的结合口袋从酵母至人类均保守。AlphaFold3预测表明人源RAD54可能采用相似机制与RAD51结合。同时，该结合位点与乳腺癌抑制蛋白BRCA2的TR2基序（亦含FxxP）结合位点重叠，提示多种调控因子可能通过同一表面裂隙时空特异性调控HR不同阶段。Rdh54虽为Rad54同源物，但其通过NTD以不同机制结合Rad51，且不受Hed1抑制，进一步印证结合模式的多样性。

减数分裂中Rad51与Dmc1调控的结构基础

Hed1与Rad54结合Rad51的同一表面裂隙，但取向相反且机制迥异，导致其结合 mutually exclusive，从而在减数分裂中实现Rad51活性的特异性下调。Hed1对Rad51的选择性（不抑制Dmc1）源于其C端区域与Dmc1的多个潜在 steric clashes 及关键互作残基的差异（如Rad51的E108、E156、D149、Q267在人Dmc1中分别为N44、R92、V85、E203），这些差异破坏了氢键、疏水作用及空间兼容性，确保Dmc1在减数分裂中作为同源染色体间重组的主要酶行使功能。

通过翻译后修饰调控Rad54结合

在S. cerevisiae减数分裂中，Mek1对Rad54-T132的磷酸化可能通过在其FxxP基序附近引入磷酸基团而削弱与Rad51的互作。但该调控机制可能仅适用于酵母，因T132在高等生物中多被赖氨酸取代。Hed1的T40亦可被Mek1磷酸化以增强其稳定性，表明减数分裂中Rad51互作因子的调控存在协同磷酸化机制。

方法

冷冻电镜样品制备

Rad54（101-144）与Hed1（118-156）肽段由Genscript合成（纯度>95%），溶于PBS + 1mM DTT中。将Rad51与96聚体ssDNA在HR缓冲液（30mM Tris pH7.5, 20mM MgCl₂, 50mM KCl, 1mM DTT, 2mM ATP）中预孵育，加入8倍摩尔过量肽段后继续孵育，取3.5μL样品置于经辉光放电处理的UltrAuFoil金网上，通过Vitrobot Mark IV在4°C、100%湿度下速冻。

冷冻电镜数据采集

初筛使用Glacios（200keV），高分辨率数据采集使用Titan Krios（300keV）配K3直接电子探测器。Rad54复合物与Hed1复合物分别以105K（像素尺寸0.844?）和85K（1.083?）放大倍数、累计剂量59.51e^?/?2和51.21e^?/?2、散焦范围-0.8至-2.5进行采集。

冷冻电镜数据处理

使用CryoSPARC v4.3.1进行处理。经运动校正、CTF估计、颗粒挑选、2D/3D分类及优化后，Rad54复合物最终使用363,379颗粒获得3.26?分辨率结构（FSC=0.143）；Hed1复合物使用876,496颗粒获得2.81?分辨率结构（FSC=0.143）。

结构优化与分析

以既往Rad51-ssDNA结构（PDB:9D46）为引导，通过Chimera手动拟合AlphaFold3预测的肽段结构，经Phenix刚体优化和实空间优化后，通过Coot校正侧链。相互作用表面面积通过PDBe PISA计算，静电作用通过UCSF Chimera的FindHBond工具验证（距离<4?，角度110-180°）。

其他方法

生物信息学分析、蛋白质纯化、AlphaFold3结构预测、生化实验与遗传学 assay 的详细信息见补充材料。