综述：Asp/ASPM蛋白在细胞周期中的磷酸化调控

本综述深入探讨了Asp/ASPM蛋白在细胞周期进程中的磷酸化调控机制及其在疾病中的作用。文章通过跨物种比较和蛋白质结构预测分析，提出Asp/ASPM是细胞周期蛋白依赖性激酶（CDK1）调控的关键候选底物，其N端富含的S/T-P磷酸化位点和多个cyclin结合基序可能通过调控蛋白质构象变化（如CH结构域和HEAT重复序列的可及性）来协调其在间期（如DNA损伤修复）和有丝分裂期（如纺锤体组装）的双稳态功能。作者进一步探讨了ASPM功能失调与小头畸形（microcephaly）和癌症（如通过稳定cyclin E促进基因组不稳定性）的关联，强调了比较人类与果蝇（Drosophila melanogaster）Asp/ASPM蛋白差异的科研价值。

　　

Abstract

在哺乳动物和果蝇（Drosophila melanogaster）中，Asp/ASPM蛋白参与细胞增殖和纺锤体形成。近期证据表明其在间期也具有功能，但调控其在不同细胞周期阶段发挥不同作用的机制尚不明确。本综述结合细胞周期蛋白-CDK（cyclin–CDK）相关文献，通过跨物种比较Asp/ASPM蛋白序列，提出Asp/ASPM蛋白是cyclin–CDK调控的主要候选对象。其保守的调控特征包括N端脯氨酸导向的丝氨酸/苏氨酸（S/T-P）“超迁移”磷酸化结构域（常见于具有双稳态间期和有丝分裂功能的蛋白质），以及可能允许cyclin–CDK复合物进行多位点磷酸化的推定cyclin结合位点。人、小鼠和果蝇Asp/ASPM蛋白的结构预测显示，N端超迁移结构域的多位点磷酸化可能改变CH结构域和HEAT基序的可及性，这些结构域参与微管结合和蛋白质聚集，可能与纺锤体形成有关。对最小报道的小头畸形患者截短蛋白的结构预测也强调了这些基序排列的重要性。我们将此in silico分析与近期文献结合，构建了关于Asp/ASPM在间期和有丝分裂中调控以及在小头畸形和癌症中失调的新假设，并强调了比较人ASPM与果蝇Asp的结构/功能差异以获取进一步见解的实用性。

1. Introduction

真核细胞增殖需要形成有丝分裂纺锤体装置以精确分离复制的DNA。果蝇基因abnormal spindle（asp）的产物通过交叉连接纺锤体极的微管负端贡献于纺锤体形成。其人类直系同源基因assembly factor for spindle microtubules（ASPM）也参与纺锤体极组织。ASPM的过表达与多种癌症相关，而ASPM编码序列的突变是人类小头畸形（脑体积减小）的主要遗传原因。果蝇asp表达 disrupted 也与脑体积减小相关。

在神经祖细胞增殖中特别重要的Asp/ASPM蛋白机制性作用包括对纺锤体微管组织的多种贡献。ASPM定位于间期核，并与DNA损伤修复相关。因此，ASPM功能丧失可能导致基因组不稳定性；果蝇Asp也有类似作用的建议。然而，解释ASPM过表达与癌症进展正相关的机制尚待确定。此外，允许Asp/ASPM蛋白在间期和有丝分裂中发挥不同作用的细胞周期依赖性调控尚不清楚。本文通过跨物种in silico分析Asp/ASPM蛋白序列，提出这些蛋白是细胞周期主要调控因子cyclin-dependent kinase 1（CDK1）翻译后调控的主要候选对象。我们将此分析与近期文献结合，为解释小头畸形患者突变导致的ASPM失调以及ASPM蛋白过量如何停滞S期、贡献于基因组不稳定性和癌症的新假设奠定基础。最后，我们建议比较哺乳动物和果蝇Asp/ASPM蛋白的结构/功能可能产生重要见解。

2. Cross-species comparison of Asp/ASPM protein sequences suggests conserved CDK1-regulation throughout the cell cycle

ASPM在有丝分裂和间期核作用的描述表明该蛋白必须在整个细胞周期中受调控。CDK1是主要的细胞周期激酶，负责磷酸化特定靶蛋白以在整个细胞周期中按需改变其功能。CDK1与各种cyclin蛋白形成复合物，允许在细胞周期特定阶段结合底物，贡献于底物活性的时间调控。因此，我们评估了Asp/ASPM蛋白序列以确定是否存在CDK1磷酸化基序或cyclin结合位点，表明CDK1可能是Asp/ASPM的候选调控因子。

对于果蝇Asp、小鼠Aspm以及人类ASPM的两种National Center for Biotechnology Information所列转录变体，N端存在保守的脯氨酸导向丝氨酸/苏氨酸（S/T-P）最小共识基序簇，用于CDK1介导的磷酸化。此外，与在整个细胞周期中表达的cyclin相关的结合基序位于Asp/Aspm/ASPM蛋白序列上。

2.1. Multisite phosphorylation of Asp/ASPM N-terminus

CDK1需要在整个真核生物中高度保守的细胞周期特定阶段磷酸化众多底物。底物磷酸化的时间特异性可通过CDK1进展通过不同“阈值”活性水平来实现，以磷酸化不同底物。许多CDK1底物具有多个保守性差的S/T-P基序区域， proposed 这些区域的主要功能可能是“吸收最初增量”的低激酶活性水平，保留功能变化用于高CDK1活性阶段。所有版本的Asp/ASPM都具有多个N端最小CDK1磷酸化基序。与CDK1底物Wee1类似，Asp/ASPM S/T-P基序在物种间数量和 intervening 残基数量也不同，支持磷酸化依赖性三级结构变化可能在高CDK1活性导致该区域磷酸化饱和之前无关紧要的观点。

Alternatively, 近期证据表明，多个CDK1磷酸化基序 stretch 内特定磷酸化残基 constellation 可导致不同的功能后果，作为“条形码”签名以根据细胞事件 facilitate 特定作用。

高CDK1活性与M期许多蛋白质磷酸化状态的突然变化一致，遵循 sigmoidal 而非线性动力学。多位点磷酸化可贡献于此开关式、超敏感响应，以创建M期和间期作为离散状态所需的双稳态。在M期 onset 磷酸化的蛋白质丰度被称为“M期超迁移”，涉及用于蛋白质磷酸化的“超迁移结构域”，这些结构域含有高丰度S/T-P基序，可能以位点非特异性方式被磷酸化，不限于CDK1。因此，Asp/ASPM上簇集S/T-P基序的N端磷酸化可能代表一个“超迁移结构域”，其磷酸化可能由CDK1和其他激酶介导。

Indeed, 蛋白质结构预测显示，对于人、小鼠和果蝇Asp/ASPM蛋白，N端是一个非结构化环，在推定N端超迁移结构域的多位点磷酸化后形成多个α螺旋。有趣的是，这种结构变化可能改变CH结构域和HEAT结构域的可及性，这可能对微管结合或蛋白质 condensates 形成很重要。位点特异性和产生超迁移的磷酸化可能 cooperatively 调控Asp/ASPM：例如，位点特异性磷酸化可能 priming 蛋白质用于后续位点非特异性超迁移磷酸化。如下所述，Asp/ASPM蛋白上丰富的cyclin结合位点可能影响磷酸化动力学，无论N端S/T-P基序是否是超迁移结构域的一部分或用于CDK1介导的多位点条形码或阈值磷酸化。需要实验证据确定哪种可能性最可能；然而，所有这些可能性都将 enable Asp/ASPM蛋白功能所需的 distinct shift，用于M期和间期中Asp/ASPM蛋白的 distinct 双稳态作用。

2.2. Cyclin-binding opportunities for Asp/ASPM throughout cell cycle

果蝇Asp、小鼠Aspm以及两种人类ASPM蛋白异构体都具有高数量的推定cyclin结合基序。Cyclins与CDK1复合作用以增强底物对CDK1活性的敏感性。差异表达的cyclins可以引导CDK1在整个细胞周期特定时间高效磷酸化特定底物，创建一套复杂的阈值，用于底物活性变化以在细胞周期阶段之间进展。

近期工作回顾了实验显示 confer 对接特异性给在S. cerevisiae细胞周期特定阶段表达的cyclins的短线性基序（SLiMs），并识别了一个具有G2-cyclin特异性的SLiM：总结来说，含有LP、RxL、PxF和LxF基序的底物分别被G1、S、G2和M期cyclins偏好。这些基序也被实验证明影响人类cyclin–CDK复合物的结合。大多数SLiMs相对较短，长度为3–8个氨基酸，其中平均只有2个是固定的，并且优先位于蛋白质序列的非结构化区域：因此，这些位点具有高趋势通过趋同进化产生，可能并非全部功能性的。我们因此评估了推定cyclin结合位点的分组以确定是否有任何这些基序显示保守的非随机分布。值得注意的是，RxL位点 across 人类ASPM-2和果蝇Asp蛋白序列的分布相对均匀，而 across 人类ASPM-1和小鼠Aspm蛋白序列的RxL位点分布权重在 spanning 多个IQ基序的区域。RxL位点被S期表达的cyclins识别，并已被证明在包括哺乳动物的高等真核生物中保守，支持Asp/ASPM蛋白间期调控的可能性。

人类ASPM-1和ASPM-2转录变体的编码序列 differ by 单个外显子的插入， dramatically 增加了IQ基序 spanning 区域的大小：该外显子的蛋白质产物也含有这些额外的RxL基序。增强结合S期cyclins的能力可能区分ASPM-1和ASPM-2蛋白的功能作用，并在下文进一步讨论。果蝇Asp中RxL基序的排列与ASPM-2相似，果蝇和哺乳动物Asp/ASPM蛋白功能之间的物种比较可能产生重要见解。

在酵母中，CDK1与S期cyclin Clb5形成复合物以识别底物中的RxL基序，这些底物对DNA复制和防止S期再复制很重要。在人类中，RxL基序已被报道影响CDK1活性以及由cyclins A、B或E介导的CDK2活性。积累证据表明，多个cyclins和CDKs可以合作以在整个细胞周期 distinct 时间精细调整底物功能。由于许多串联排列的SLiMs可以 act to 协调多个相互作用界面 simultaneously， proposed 特定线性排列的cyclin结合基序， coupled with CDK磷酸化位点，赋予CDK底物独特 identity。Asp/ASPM蛋白中识别的cyclin结合基序可能 facilitate 上述多位点磷酸化，以 confer Asp/ASPM蛋白在间期和M期的不同功能作用。

3. De-regulation of Asp/ASPM protein function in disease

预测为人类ASPM功能丧失的突变是小头畸形的最常见遗传原因， characterized by 发育中大脑细胞增殖减少。Conversely, 人类ASPM的过表达与许多癌症中的细胞过度增殖相关。 below 我们考虑中断Asp/ASPM与cyclin–CDKs之间的相互作用如何贡献于中断间期或有丝分裂期Asp/ASPM蛋白功能和疾病病理。

3.1. ASPM patient mutations alter predicted structural arrangement of HEAT repeats relative to CH-domains

Asp/ASPM表达丧失或蛋白质截短功能改变影响有丝分裂的多个方面以贡献于果蝇、小鼠和人类的小头畸形表型。为了确定整个细胞周期中CDK-cyclins调控中断是否也可能是ASPM相关小头畸形的一个因素，我们检查了78个导致小头畸形的患者突变 nonexhaustive 列表，以评估任何相应的氨基酸 disruption 是否位于人类ASPM-1上的CDK1磷酸化或cyclin结合位点附近。

正如先前描述的，大多数导致小头畸形的患者突变导致编码移码或截短，预测 disrupt ASPM蛋白质翻译，并可能 disrupt 所有下游调控和功能位点的完整性。我们的分析未显示有限数量的点突变对应于特定CDK/cyclin调控区域；然而，构象影响不能排除，仍有待实验探索。

我们的分析突出了某些可能值得未来研究的ASPM蛋白质结构域。例如，最短的导致小头畸形的无义突变会导致仅21个C端氨基酸的蛋白质截短，这突出了C端区域的重要性。ASPM C端包括保守的HEAT重复，这些是高度灵活的结构域，支持响应环境因素（如离子强度或大分子 crowding）的分子内相互作用，正如在有丝分裂纺锤体极 found。在所有评估物种的结构预测中，C端HEAT重复预测与N端Hydin基序和CH结构域紧密接近。这种接近性被c. 10369 deletion中断，表明维持这些结构域的特定 constellation 可能对蛋白质功能重要。

此外，几个导致小头畸形的剪接位点突变聚集在CH结构域编码区域周围的gDNA，这可能导致无义介导的RNA衰变，尽管这仍有待实验验证。其中，该区域的两个患者点突变是外显子的，如果剪接未中断，可能改变蛋白质功能。CH结构域贡献于与肌动蛋白或微管蛋白的蛋白质相互作用，果蝇中的工作表明，过表达含有CH结构域的Asp片段导致微管超捆绑。

如上所述，多位点N端磷酸化可能以细胞周期依赖性方式改变这些潜在微管蛋白结合聚集位点的可及性，受CDK/cyclins调控。

在近期全面描述总计211个导致小头畸形的ASPM患者突变中，仅报告了三个非剪接位点错义突变，所有这些都会改变 spanning 多个IQ基序区域内的氨基酸。所有Asp/ASPM蛋白都具有多个重复IQ基序，预测与保守钙感应蛋白钙调蛋白（CaM）相互作用。最大的ASPM蛋白质异构体被 suggested 通过CaM积累 up to 几百个钙离子。在膜脂质研究中，钙快速流入水基系统可以逆转膜双层之间的静电排斥，贡献于快速纳米结构域相变。

蛋白质聚集体 long proposed 形成不溶性基质以贡献于纺锤体极聚焦，这可能通过非膜 bound condensates 或相变实现以 restrain 纺锤体极蛋白质的定位。CaM在其他上下文中贡献于相分离：人类细胞 adhesion 支架分子Discs-Large（hDLG）形成相分离纳米结构域，该域与CaM检测细胞钙水平合作调控。hDLG的异构体在与CaM关联动力学和纳入纳米结构域形成方面 differed。ASPM异构体在IQ基序数量上 differ，这可能类似地设置与CaM合作蛋白质 oligomerization 或纳米结构域形成的不同阈值；这些阈值可能被IQ基序区域内的错义突变中断。纺锤体极的蛋白质聚集可能 further 受Asp/ASPM CH和HEAT结构域的可及性影响。CDK/cyclin结合调控这些结构域在整个细胞周期中可及性的潜力仍有待确定。

3.2. ASPM overexpression may impact cyclin dynamics contributing to cancer

ASPM在多种人类癌症中过表达，并与更高肿瘤分级和更低存活率相关，表明细胞周期失调，尽管分子机制仍不清楚。如上所述，人类ASPM异构体 differ by 一个外显子的插入， greatly 增加了IQ基序和RxL（S期）cyclin结合位点的数量。 demonstrated cyclin E与ASPM-1和ASPM-2共沉淀，但只有长的ASPM-1异构体保护cyclin E免于泛素化和降解。Cyclin E表达在G1期达到峰值，同时ASPM也有一个间期表达峰值。Cyclin E可以与RxL位点相互作用并贡献于预复制复合物形成和G1-S期进展。

由于ASPM-1强烈与cyclin E共沉淀并保护cyclin E免于泛素化，肿瘤细胞中ASPM的过表达可能导致cyclin E的异常稳定。cyclin E的过表达常见于癌细胞： prolonged 高水平的cyclin E和异常底物磷酸化与S期缺陷相关，包括增加DNA复制起点和丧失DNA复制底物，以及 anaphase 中的染色体错误分离。这些事件都可能促进遗传不稳定性并增加肿瘤发生突变的可能性，通过cyclin E稳定提供ASPM过表达与癌症之间的链接。

Cyclin E进展S期的需求可能是细胞类型依赖性的，因为cyclin E的转基因表达在ASPM缺陷小鼠中 differentially 恢复脑大小 across 脑区域。Cyclin E与cyclin A在小鼠成纤维细胞中功能冗余，但 specifically 用于 endoreplicating 细胞和从静止重新进入S期的培养细胞加载 minichromosome maintenance 蛋白质到DNA复制起点。因此，除了促进基因组不稳定性，ASPM过表达可能通过维持高水平cyclin E促进应该进入静止的细胞的循环条件。

交替ASPM异构体在细胞周期进展中的贡献仍有待确定。尽管较长的ASPM-1异构体在胰腺癌中 specifically 上调，但需要敲低 both ASPM-1和ASPM-2异构体以减少cyclin E丰度并影响G1持续时间。这些作者还描述了ASPM-1与Wnt信号之间的关系，这可能贡献于脑发育和癌症中的细胞增殖异常。 pinpoint 不同ASPM异构体的确切作用以理解疾病中的异常细胞周期进展将是重要的。由于异构体特异性分子工具的有限可用性，比较人类ASPM与缺乏大RxL/IQ-rich外显子18的物种（如果蝇Asp）的功能可能产生重要见解。

4. Conclusions and perspectives

本综述的跨物种蛋白质序列特征表明Asp/ASPM蛋白是cyclin–CDK复合物调控的主要候选对象。跨物种共享特征包括大量N端最小S/T-P磷酸化位点，这些可以 enable 响应G2/M转换时磷酸化饱和的蛋白质作用突然变化，改变CH结构域和C端HEAT基序的可及性，这些分别贡献于微管结合和蛋白质聚集。此外，Asp/ASPM蛋白上的多个推定cyclin结合基序可能 enable 精细调整的活动转换时间，遵循“条形码”cyclin–CDK活性阈值。这些特征可能导致Asp/ASPM在M期与间期的双稳态作用，贡献于有丝分裂纺锤体形成或通过cyclin E调控和DNA损伤修复维持基因组完整性。

值得调查Asp/ASPM蛋白的一个主要功能是否可能是 facilitate 蛋白质 condensates，这些 condensates 可以访问染色质或微管底物，由取决于细胞周期阶段的cyclin–CDK调控 dictate。DNA损伤与中心体/微管动力学之间的联系 well-documented，以及通过cyclin和CDK蛋白质协调细胞增殖和基因表达。理解Asp/ASPM蛋白的作用机制将贡献于这些链接功能的见解。利用果蝇和哺乳动物Asp/ASPM蛋白之间的结构差异将帮助实现更好理解与特定蛋白质功能结构域相关的分子机制、这些结构域的组织特异性需求、以及导致小头畸形或癌症的失调的分子原因。