利用重复元件比较分析与S基因组特异性荧光原位杂交（FISH）技术解析拟斯卑尔脱山羊草与小麦的进化关系及染色质追踪

本文通过比较基因组学方法，系统分析了拟斯卑尔脱山羊草（Aegilops speltoides）与六倍体小麦各亚基因组（AABBDD）的重复序列组成，发现S基因组特异性分散重复元件（TEs），并成功开发了可用于荧光原位杂交（FISH）的特异性探针，为小麦背景中外源染色质的快速、精准检测提供了新技术手段，对小麦遗传改良和进化研究具有重要意义。

　　

Abstract

拟斯卑尔脱山羊草（Aegilops speltoides，2n=2x=14，SS基因组）是小麦的近缘野生种，也是小麦遗传改良中诸多优良性状（如抗病性、抗逆性）的重要供体。全基因组比较研究表明，尽管拟斯卑尔脱山羊草与小麦B亚基因组亲缘关系最近，但并非其直接祖先，二者早在超过400万年前就已发生分化。为进一步探究其与小麦的进化关系并开发可用于追踪其染色质的细胞学工具，本研究对拟斯卑尔脱山羊草S基因组与六倍体小麦A、B、D三个亚基因组的重复序列进行了系统的比较分析。

Introduction

拟斯卑尔脱山羊草分布于新月沃地，其基因组（SS）是小麦B亚基因组的重要近缘参照。六倍体小麦（Triticum aestivum，AABBDD）的形成经历了两次杂交事件：一次是约80万年前A基因组供体（与乌拉尔图小麦Triticum urartu近缘）与B基因组祖先杂交形成四倍体小麦（AABB），另一次是约1万年前四倍体小麦与D基因组供体粗山羊草（Ae. tauschii）杂交。研究表明，小麦B亚基因组的直接祖先可能尚未发现或已灭绝。

禾本科植物基因组的80%以上由重复序列构成，其中反转录转座子（LTR retrotransposons）占据主导地位。多倍化事件可能引发重复序列的剧烈变化，包括特定转座元件（TEs）家族的扩增或删除。尽管有研究认为小麦多倍化后未发生TEs的大规模爆发，但也有证据表明四倍化事件后A、B亚基因组中确有近期TEs的扩增。比较发现，虽然S基因组（~5.81 Gb）与B亚基因组（~5.11 Gb）大小相近且进化关系最近，但其重复序列的组成和含量存在显著差异，例如S基因组含有更多的Copia类反转录转座子（Ty1-Copia）和更少的DNA转座子。

目前，追踪小麦背景中的拟斯卑尔脱山羊草染色质主要依靠基因组原位杂交（GISH），但其过程繁琐，需用未标记的小麦基因组DNA进行封闭，重复性差，且难以进行多色FISH多重检测。开发基于物种特异性分散重复序列的FISH探针（染色体绘画，chromosome painting）是解决该问题的理想方案。

Materials and methods

研究采用拟斯卑尔脱山羊草TA2780 accession及小麦-拟斯卑尔脱山羊草1S附加系（DA1S TA7689）等材料。对拟斯卑尔脱山羊草进行低深度基因组测序（Illumina MiSeq，~0.89x覆盖率），并利用公共数据库中已发表的流式分选小麦单条染色体（7A, 3B, 2D）的测序数据代表A、B、D亚基因组。

核心分析采用RepeatExplorer（RE）管道，这是一种基于图的聚类算法，无需全基因组组装即可对低深度测序数据进行重复序列注释和定量。通过比较分析，寻找在S基因组中含量显著高于小麦亚基因组的重复序列簇。对筛选出的S基因组特异性序列进行PCR扩增、克隆、测序，并制备成FISH探针。同时，还根据RE的TAREAN工具结果，为已知的串联重复序列（如Spelt1, Spelt52, pTa713）设计了寡核苷酸探针。

Results

Content and composition of repeats in Ae. speltoides genome

RE分析表明，拟斯卑尔脱山羊草基因组中85.6%为重复序列。LTR反转录转座子占主导地位，其中Ty3/Gypsy类占比最高（39.0%），其次是Ty1/Copia类（21.0%）。DNA转座子占8.0%。卫星DNA（串联重复）占3.0%，核糖体DNA（rDNA）占0.9%。在Ty3/Gypsy中，Retand、Tekay、Athila和CRM亚型最为丰富；在Ty1/Copia中，Angela和SIRE亚型占多数。

Comparative analyses of dispersed repeats in Ae. speltoides and wheat

对S基因组与小麦单条染色体（代表A、B、D亚基因组）的重复序列进行个体及比较分析发现，四者中LTR反转录转座子均约占分散重复序列的80%，且以Ty3-Gypsy为主。但与小麦相比，S基因组的Ty1-Copia类元件多出1.5倍，而DNA转座子则少1.5倍。比较分析揭示了多个在S基因组中特异性富集或存在的重复序列簇，它们主要属于Ty1_copia/SIRE和Ty3_gypsy/Retand两类反转录转座子。S基因组与B亚基因组的特异性比较进一步证实，S基因组在Angela、SIRE、Retand和CRM等TE亚型上更为富集，而B亚基因组则在Athila和EnSpm_CACTA等亚型上含量更高。

Detection and annotation of Ae. speltoides-specific repetitive sequences and development of S genome FISH paints

通过比较分析，筛选出20个在S基因组中特异性高丰度的重复序列簇。从中选取了23条序列 contig 用于设计26对引物并制备FISH探针。经过测试，4个来源于Ty1_copia/SIRE元件的PCR产物（对应克隆命名为pAsp2-14, pAsp3-37, pAsp7-26, pAsp11-28）能在小麦背景中对1S染色体产生明亮且特异的“绘画”式杂交信号。将它们与标记串联重复Spelt52的寡核苷酸探针混合使用，效果更佳。该探针组合不仅能清晰显示整条1S染色体，还能有效检测小麦-拟斯卑尔脱山羊草重组染色体中的微小片段。

序列注释表明，这些特异性序列对应于Ty1_copia/SIRE类反转录转座子的内部区域，如RT（逆转录酶）、INT（整合酶）、RH（RNA酶H）等蛋白结构域以及eORF（extra Open Reading Frame）。例如，pAsp2-14和pAsp3-27与大麦（Hordeum vulgare）的反转录转座子Lara有80-83%的相似性；pAsp7-26和pAsp11-28则与小麦中的Barbara B元件有高度相似性。

Discussion

Content and composition of repeats in Ae. speltoides and wheat

本研究通过RE对低深度测序数据的分析结果，与已发表的基于全基因组组装的拟斯卑尔脱山羊草重复序列分析（Li et al., 2022）高度一致，验证了RE方法的可靠性。同时，使用单条染色体数据代表整个亚基因组进行分析的策略也被证明是可行的。研究表明，S基因组与小麦B亚基因组虽然亲缘最近，但其重复序列景观（repeatome）存在显著差异，这可能是数百万年独立进化过程中TE周转（TE turnover）的结果，也可能与B亚基因组经历多倍化后的变化有关。S基因组中Ty1-Copia类元件，特别是Angela和SIRE亚型的近期扩增（<0.8 MYA）是其重复序列组成的一个突出特征。

S genome-specific repeats and FISH paints

本研究成功地从S基因组中鉴定出特异性分散重复序列，并开发出能替代传统GISH、进行高效S基因组染色质检测的FISH探针（染色体绘画）。这些探针源于在S基因组中特异性扩增的Ty1_copia/SIRE类反转录转座子。相较于传统GISH，该方法无需封闭DNA，操作更简便，重复性更好，并且易于与其他探针组合进行多色FISH，实现对不同外源染色质及小麦染色体的一步式同步检测。该策略表明，RepeatExplorer管道是开发物种特异性染色体绘画探针的强大工具，可广泛应用于小麦及其他作物的远缘杂交与染色质渗入研究。