基于NGS预校正ONT读长的组装策略实现HiFi级别质量并降低成本

本研究系统评估了牛津纳米孔技术（ONT）读长经下一代测序（NGS）校正后用于基因组组装的性能，证明其可达到与高保真（HiFi）测序相当的组装质量。研究比较了Verkko、Hifiasm等混合组装工具与Shasta、Flye等ONT组装工具在低覆盖率（10–50×）下的表现，发现校正后的ONT组装在连续性和错误率方面具有优势，且成本显著降低。同时研究对比了MGI、Illumina和stLFR等NGS技术在杂合子分型、读长校正和抛光等环节的性能，为低成本高质量基因组组装提供了实践方案。

　　

基因组组装是从片段化测序数据重建完整基因组序列的关键步骤。近年来，第三代测序技术如牛津纳米孔技术（Oxford Nanopore Technologies, ONT）和高保真（HiFi）测序的出现显著提升了组装质量。然而，混合组装方法通常需要同时使用大量HiFi和超长ONT读长，成本较高。为此，本研究探索了一种低成本替代方案：使用低覆盖度的ONT读长，并通过下一代测序（next-generation sequencing, NGS）进行预校正，再输入至ONT专用组装工具中。

材料与方法

研究使用了来自Ashkenazim Trio（HG002、HG003、HG004）的公开细胞系DNA样本。测序数据包括HiFi、ONT R9、ONT R9 UL（读长>100 kb）、MGI和Illumina短读长数据。所有读长均与CHM13-v1.1参考基因组比对，并使用工具进行排序、索引和降采样至10×、20×、30×和50×覆盖度。

组装工具包括基于HiFi的混合组装工具（Verkko、Hifiasm、LJA）和基于ONT的组装工具（Shasta、Flye）。ONT读长使用Ratatosk工具进行NGS校正，校正后输入至Shasta或Flye进行组装。组装结果使用QUAST评估NG50和contig数量，使用Merqury评估QV值和k-mer完整性，并使用PEPPER和Pilon进行抛光。

研究还比较了MGI、Illumina和stLFR（single-tube long fragment read）技术在分型、校正和抛光中的表现。分型错误通过Switch Error和Hamming Error评估，校正后读长精度通过比对参考基因组计算。

ONT组装工具与混合组装工具的比较

研究首先比较了不同组装工具在组装人类1–22号染色体时的性能。结果显示，HiFi-based工具（如Hifiasm）在NG50和QV值上表现最佳，但存在更多的错误组装和碱基错配。相比之下，经NGS校正的ONT读长输入至Shasta或Flye后，组装错误率显著降低，特别是在misassembly和mismatch方面表现更优。

值得注意的是，Flye+Ratatosk组合在低覆盖度（10×）下仍能保持高连续性（NG40 Mb以上）和高完整性（>95%），而HiFi工具在低覆盖度下性能下降明显。此外，即使用于组装端粒到端粒（telomere-to-telomere, T2T）的超长读长，所有工具均未能实现真正的T2T组装，尤其在着丝粒区域存在大量错误连接。

低覆盖度下的组装性能

研究进一步评估了组装工具在10×、20×、30×和50×覆盖度下的表现。发现校正后的ONT组装方法（尤其是Ratatosk+Flye）在低覆盖度下更具稳定性。在10×覆盖度下，Flye组装的NG50和indel错误率均优于其他工具，表明其更适合低深度测序项目。

MGI、Illumina和stLFR在组装中的应用比较

研究系统比较了三种NGS技术（MGI、Illumina、stLFR）在四个方面的性能：

作为Trio数据用于单倍型分型：

Hifiasm使用MGI或Illumina Trio数据时，分型错误率相近，且stLFR（无需亲本数据）也能达到相似效果。

用于ONT读长校正：

Ratatosk使用MGI或Illumina校正ONT读长后，读长精度中位数均达到98.5%左右，两者无显著差异。

用于组装后抛光：

使用PEPPER（ONT抛光）+ Pilon（NGS抛光）后，MGI和Illumina抛光后的QV值相近。

作为Merqury的k-mer数据库：

使用不同技术构建的k-mer数据库对同一组装评估QV时，结果存在较大偏差。HiFi数据库会高估QV，而MGI和Illumina结果接近。

讨论与结论

研究表明，使用NGS校正的ONT读长进行组装可在降低成本的同时达到与HiFi混合方法相当的质量。尽管HiFi工具在连续性和QV值上略有优势，但其错误组装率较高，尤其在着丝粒区域。因此，若不追求T2T组装，推荐使用常规R9或R10 ONT读长结合NGS校正的策略。

低覆盖度下的性能优势使该方案更具成本效益。此外，MGI与Illumina在各项应用中表现相近，而stLFR可作为Trio数据的有效替代，进一步降低成本。

研究还开发并公开了Snakemake流程（https://github.com/MGI-EU/assembly_workflow），集成最佳实践方法，支持基因组组装与评估的全流程分析。

综上所述，基于NGS校正的ONT组装策略为高质量基因组研究提供了经济、可靠且易于推广的解决方案。