甘蓝型油菜‘Mendel’中鉴定出抗四种芸薹根肿菌致病型的第二基因Rcr3Mendel及其遗传定位研究

本研究发现甘蓝型油菜品种‘Mendel’中除已知抗性基因Rcr1外，还存在第二个抗根肿病主效数量性状位点（QTL）Rcr3Mendel，该基因位于A08染色体316.9 kb区域内，包含一个Toll白介素1受体-核苷酸结合位点-亮氨酸重复序列（TNL）型抗病基因，对破坏第一代抗性品种的致病型3D、5C、8J和3H均表现出高度抗性，为抗性基因聚合和持久抗病品种选育提供了重要遗传资源。

　　

引言

根肿病由专性寄生菌芸薹根肿菌（Plasmodiophora brassicae）引起，是加拿大油菜产业面临的重大威胁，可导致30%-100%的产量损失。遗传抗性是防治该病的有效策略。甘蓝型油菜（Brassica napus L.）作为全球第二大食用油来源，其生产受到根肿病的严重制约。自2003年加拿大草原地区首次发现根肿病以来，截至2020年已确认超过3300块田间感染区。

抗根肿病（CR）油菜品种于2009-2010年在加拿大首次推广，对当时所有主要致病型均有效。然而，到2013年，阿尔伯塔省的两个田间发现第一代CR油菜出现严重症状，表明病原菌已突破原有抗性。为此，加拿大开发了加拿大根肿病鉴别（CCD）系统对致病型进行更精细分类，目前已鉴定出超过30种致病型，其中3A、3D和3H最为流行。

甘蓝型油菜（AACC）是由二倍体祖先 Brassica rapa（AA）和 Brassica oleracea（CC）杂交形成的异源四倍体物种。 Brassica rapa 是根肿病抗性的重要来源，已有20多个CR数量性状位点（QTL）或基因被定位到特定染色体，包括A03染色体上的CRa、CRb、CRd等基因，以及A08染色体上的Crr1、CRs、Rcr9等基因。

欧洲冬油菜品种‘Mendel’是通过将 Brassica oleracea 品系ECD 15与 Brassica rapa 品系ECD 04杂交开发的合成种，其抗性来源于ECD 04的A基因组。先前研究表明，‘Mendel’对17种 P. brassicae 致病型中的13种具有抗性，包括在阿尔伯塔省发现的致病型3H，但对致病型5X敏感。最近研究表明，‘Mendel’中位于A03染色体的抗性基因与Rcr1相同。本研究的目的是鉴定和定位‘Mendel’中对第一代加拿大CR品种（携带Rcr1）具有攻击性的 P. brassicae 致病型的抗性基因，并开发与之紧密连锁的SNP标记，用于针对加拿大新鉴定致病型的抗性选择。

材料与方法

植物材料和F₁代开发

使用甘蓝型油菜双单倍体（DH）品系DH16516（感病）与‘Mendel’（抗病）杂交获得F₁代植株，并通过接种致病型3H评估其抗性。

DH群体开发

通过小孢子培养技术从三个抗病F₁植株开发DH群体。收集花蕾进行表面灭菌和匀浆，通过过滤和离心分离小孢子，在NLN 13培养基中添加秋水仙素进行培养，诱导胚胎发生，最终获得137个DH株系。

根肿病抗性评估

在2018-2020年期间，在生长室和温室条件下评估137个DH株系对致病型3D、5C和8J的抗性。接种体由感染根系制备，孢子浓度调整至1×10⁷个/mL。接种后5周，按照0-3级标准评估根部症状，计算疾病严重指数（DSI），以DSI≤30%为抗病（R），DSI>30%为感病（S）。使用卡方检验分析抗感分离比例。

DNA测序和短读长组装

从137个DH株系和亲本中提取DNA，使用甲基化敏感限制酶ApeKI消化后，通过基因分型测序（GBS）在Illumina平台上进行测序。短读长使用 Brassica napus ‘ZS11’参考基因组进行比对。

变异识别、连锁图谱构建和QTL检测

通过比对‘ZS11’参考基因组识别GBS-SNP变异，使用JoinMap 4.1和QTL IciMapping软件构建连锁图谱并检测QTL。使用Kosambi模型计算遗传距离，LOD值阈值设为3.0。

靶向QTL区域的基因标注

使用Blast2GO和Omicsbox对QTL区域的编码序列（CDS）进行注释，鉴定候选基因。特别关注Toll白介素1受体-核苷酸结合位点-亮氨酸重复序列（TNL）类抗病基因。

竞争性等位基因特异性PCR（KASP）

使用KASP分析验证GBS鉴定的SNP，并开发与抗性表型共分离的标记。使用 Brassica rapa ‘Chiifu’ v3.0和 Brassica napus ‘ZS11’、‘Darmor-bzh’ v4.1参考基因组进行标记开发。

结果

亲本和F₁代的根肿病抗性

亲本DH16516和感病对照NRC11-24对所有三个致病型高度感病（DSI=100%），而‘Mendel’、抗病对照AAFC-Y12、AAFC-Y68和F₁植株均高度抗病（DSI=0%）。群体中DSI值在三个致病型间高度相关（r≥0.82）。137个株系中，107-110个株系被分类为抗病，27-30个为感病。卡方检验表明抗感分离符合3:1比例，表明抗性可能由两个基因控制。

GBS分析和SNP识别

抗病亲本‘Mendel’产生0.99百万条短读长序列，其中0.88百万条（89%）比对到参考基因组，覆盖深度0.2X，识别出40,000个SNP。感病亲本DH16516产生219.9百万条短读长，202.5百万条（92%）比对到参考基因组，覆盖深度21X，识别出约1200万个SNP。137个DH株系共产生约705百万条短读长，635百万条（90%）比对到参考基因组，识别出约3800万个SNP。

变异分析和连锁图谱构建

在DH群体中共识别出81,453个SNP。经过过滤后，保留2,642个高质量SNP，分布在19条染色体上，平均每条染色体139个SNP。遗传图谱总长5834.7 cM，平均每条染色体307.1 cM。缺失率为4.5%，观察到约111个偏分离标记。

QTL检测和定位

使用2,642个SNP和表型数据对致病型5C、3D和8J进行QTL定位，在A08染色体上检测到一个主效QTL，命名为Rcr3^Mendel。该QTL两侧标记为ZS_A08_15999175（左）和ZS_A08_16316110（右）。LOD值范围为63-68，表型变异解释率（PVE）为88%-90%，加性效应（Add）为47%，置信区间为4.1 cM。

候选基因识别

在Rcr3^Mendel区域的316.9 kb区间内鉴定出43个基因，其中包括一个TNL基因BnaA08T0102200ZS（ZS_A08_16222504 – ZS_A08_16225680）。该基因与拟南芥AT5G51630和 Brassica rapa BraA08g016670.3C同源，编码疾病抗性蛋白。

在抗性供体ECD 04基因组中，Rcr3^Mendel区间对应A08染色体13,415,472-15,791,728 bp区域，该区域包含10个与植物抗病相关的基因，其中BraA08g039211E和BraA08g039212E编码TNL蛋白。

KASP分析和QTL验证

使用13个SNP标记构建连锁图谱，发现9个标记与Rcr3^Mendel共分离：DM_A08_8423386、CF_A08_12275702等。Rcr3^Mendel一侧由标记CF_A08_10228875、CF_A08_10850444和CF_A08_11672817界定，另一侧由DM_A08_6311698界定。其中CF_A08_11021839和CF_A08_11466518先前已被关联到 Brassica rapa 中的Rcr3。

Rcr3^Mendel对致病型3H的抗性

对60个DH株系接种致病型3H，发现对3H的抗性与对5C、3D和8J的抗性共分离，表明Rcr3^Mendel很可能与Rcr3相同。

讨论

本研究通过GBS和KASP分析，在甘蓝型油菜‘Mendel’中鉴定出一个对 P. brassicae 致病型3D、5C和8J具有抗性的主效QTL Rcr3^Mendel，定位在A08染色体上。该QTL与先前在 Brassica rapa ‘Wasalander’（ECD 04）中鉴定的Rcr3位于相同区域。

DH株系对三个致病型的DSI值高度相关，抗病株系对所有致病型均表现出强烈且一致的抗性（DSI=0%），支持抗性由主效基因控制的假设。抗感分离符合3:1比例，表明抗性由两个基因控制，但只检测到一个主效QTL，这可能源于小孢子培养中的偏分离现象。

Rcr3^Mendel被界定在316.9 kb区域内，两侧标记为ZS_A08_15999175和ZS_A08_16316110。在该区域内鉴定出43个基因，其中包括一个TNL基因BnaA08T0102200ZS。TNL类基因在根肿病抗性中起重要作用，通过诱导抗病蛋白和介导信号转导发挥作用。

对60个DH株系的接种试验表明，Rcr3^Mendel也对致病型3H提供抗性，且与对5C、3D和8J的抗性共分离，表明Rcr3^Mendel很可能与Rcr3相同。

比较基因组学分析显示，Rcr3^Mendel对应 Brassica rapa ‘Chiifu’ v3.0参考基因组A08染色体11.0-12.3 Mb区域，该区域已知存在多个CR基因和QTL，包括Rcr9、Rcr9^ECD01、Rcr9^wa等。然而，基于抗性谱分析，Rcr3^Mendel与这些已知基因存在明显区别：‘Mendel’对致病型3A和5X敏感，而Rcr9^ECD01和Rcr9^ECD02对这两种致病型具有抗性；ECD 04对致病型5X抗病而‘Mendel’感病，表明Rcr9^wa可能未在杂交过程中被遗传。

结论

本研究使用137个DH株系将‘Mendel’中对 P. brassicae 致病型3D、5C和8J的抗性定位到A08染色体上的一个主效QTL Rcr3^Mendel，该QTL解释88%-90%的表型变异。KASP分析确认8个共分离标记，对60个DH株系的接种表明Rcr3^Mendel也对致病型3H提供抗性。该基因被界定在316.9 kb区域内，对应 Brassica rapa ‘Chiifu’ 11.0-12.3 Mb区域，包含一个TNL候选基因。尽管Rcr3^Mendel与已知QTL区域存在重叠，但证据表明它是一个 distinct 的抗性基因，需要进一步通过精细定位、基因克隆和田间试验验证其功能。