基于生物信息学分析揭示SPARC作为牙源性角化囊肿基底膜相关基因的功能价值及其在免疫微环境调控中的作用

本研究通过整合转录组学与单细胞测序技术，首次系统鉴定牙源性角化囊肿（OKC）中65个差异表达的基底膜相关基因（BM DEGs），并揭示SPARC作为核心调控因子通过影响Hedgehog/NOTCH通路、调控免疫细胞浸润（如效应记忆CD4+ T细胞与记忆B细胞）及促进基质纤维细胞活化驱动OKC进展的分子机制，为靶向SPARC的治疗策略提供理论依据。

　　

背景：牙源性角化囊肿（Odontogenic Keratocyst, OKC）是一种具有高复发率的侵袭性颌骨病变。基底膜（Basement Membrane, BM）破坏可能参与其发病机制，但具体分子机制尚未完全阐明。本研究旨在通过生物信息学方法分析OKC中BM相关基因（BMGs）的表达模式及功能。

方法：研究分析了来自GEO数据库的12例非综合征型OKC和4例正常口腔黏膜（NOM）样本的转录组数据（GSE38494）。通过差异表达分析筛选BM相关差异表达基因（BM DEGs），并采用功能富集分析（包括Gene Ontology、KEGG、GSEA）、蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络构建、免疫浸润评估以及单细胞RNA测序（scRNA-seq，GSE176351）进行验证。关键发现通过免疫组织化学和免疫荧光在临床标本中确认。

结果：共鉴定出65个BM DEGs，其中分泌性酸性半胱氨酸丰富蛋白（SPARC）为最显著上调基因（P < 0.01）。PPI及相关性分析确立SPARC为核心基因，与已知OKC标志物（PTCH1、GLI1、GLI2、KRT19）显著相关（P < 0.05）。单细胞测序显示SPARC高表达于基质纤维细胞。免疫组化及免疫荧光证实OKC基质中SPARC表达显著高于NOM（P = 0.001）。SPARC水平与免疫浸润特征相关，与效应记忆CD4⁺ T细胞呈正相关，与记忆B细胞呈负相关。研究还构建了SPARC的转录因子和microRNA调控网络。

结论：本研究证实BMGs的失调（特别是基质纤维细胞特异性SPARC过表达）是OKC发病机制的重要因素。SPARC与关键OKC通路（Hedgehog、NOTCH）相互作用并调节免疫微环境。这些发现为理解OKC的侵袭性提供了基础见解，并提示SPARC作为潜在治疗靶点。

材料与方法：OKC组织样本取自武汉大学口腔医院口腔颌面-头颈肿瘤科，NOM组织来自唇腭裂修复手术患者。所有组织经4%多聚甲醛固定、石蜡包埋并切片。研究遵循美国国立卫生研究院人体组织使用指南，并获得武汉大学口腔医院伦理委员会批准（IRB-ID: 2020A95）。通过GEO数据库获取RNA-seq数据集，包括12例NS-OKC和4例NOM样本（GSE38494）。基于bmBASE数据库定义的222个BMGs，使用R包“ggvenn”识别BM DEGs。基因表达分析采用“limma”包，以|log₂FC| > 1且P < 0.05为显著性阈值。功能富集分析通过GO、KEGG和GSEA进行。PPI网络利用STRING数据库构建（置信度评分≥0.7），并通过Cytoscape可视化。从GeneCards数据库获取23个OKC相关基因进行相关性分析。使用“sva”包合并数据集并校正批次效应。基因集变异分析（GSVA）基于SPARC表达水平将样本分为高、低表达组。单细胞测序数据（GSE176351）经质量控制和“harmony”包整合后，通过“seurat”包进行细胞聚类和可视化。SPARC的转录因子（TF）和microRNA（miRNA）调控网络通过NetworkAnalyst构建，TF数据源自ChIP-X数据库，miRNA数据来自miRTarBase v8.0。免疫浸润分析使用包含782个基因的集合评估28种肿瘤浸润免疫细胞（TIIC）的丰度。免疫组化和免疫荧光采用标准protocol，SPARC抗体（1:100, #A14494, ABclonal）孵育后，分别使用DAB显色和AlexaFluor 488标记二抗检测。数据分析使用R软件（4.2.3版），组间比较采用Wilcoxon秩和检验，相关性分析使用Spearman方法，P < 0.05视为显著。

结果详述：差异表达分析识别出1,780个DEGs，与BMGs取交集后获得65个BM DEGs。热图及箱线图显示SPARC在OKC组织中表达最高（P < 0.01）。GO分析显示BM DEGs显著富集于“细胞外基质组织”、“胶原containing细胞外基质”等生物学过程及细胞组分，KEGG分析提示“ECM-受体相互作用”、“focal adhesion”等通路富集。GSEA揭示DEGs中最显著上调和下调通路。PPI及相关性网络均表明SPARC处于核心地位。SPARC与OKC相关基因（PTCH1、GLI1、GLI2、KRT19）表达正相关（P < 0.05）。GSVA显示高SPARC表达与“上皮细胞凋亡负调控”、“轴突形成参与神经支配”等过程相关。TF调控网络涉及多能性因子（POU5F1、SOX2、NANOG）、核受体（PPARG、AR）及应激响应TF（STAT5A、HSF1），miRNA网络包括miR-29家族（hsa-mir-29a-5p/3p）和癌症相关miRNA（hsa-mir-192-5p、hsa-mir-26b-3p）。单细胞测序验证SPARC在纤维细胞中表达最高，上皮细胞次之。独立数据集（GSE228393、GSE186489）验证SPARC在OKC中表达显著高于NOM（P = 0.026）。免疫荧光显示SPARC在OKC基质区强表达，免疫组化定量分析（H-score）证实OKC基质SPARC表达显著高于NOM（P = 0.001）。免疫浸润分析显示SPARC与效应记忆CD4⁺ T细胞（P = 0.001）、浆细胞样树突细胞（P = 0.020）、滤泡辅助T细胞（P = 0.022）及γδ T细胞（P = 0.036）正相关，与记忆B细胞（P < 0.001）和Th17细胞（P = 0.026）负相关。

讨论：本研究通过多组学方法揭示OKC中BMGs的失调网络，SPARC作为核心分子通过调控ECM-细胞相互作用、信号通路（Hedgehog/NOTCH）及免疫微环境驱动疾病进展。其表达受转录因子（如EP300、SOX2）和miRNA（如miR-29a）多层次调控。基质纤维细胞来源的SPARC可能通过促进上皮增殖、破骨细胞生成及血管生成增强OKC侵袭性。免疫相关性分析提示SPARC可能影响B细胞功能及局部炎症反应。未来需通过功能实验及临床样本验证SPARC的靶向价值，为OKC治疗提供新策略。