负压条件下木质部汁液胞外冻结机制解析：冰核形成与纳米气泡竞争的物理本质

本综述系统探讨了植物木质部汁液在负压（水势，water potential）下的独特冻结行为。研究通过冷台实验发现，离体汁液冻结点比枝条内低约10°C，且与提取前水势无关，表明冻结是由木质部导管壁表面孔隙介导的物理过程。作者提出“Goldilocks模型”，揭示了孔隙尺寸分布、冰核临界半径（rnucleus）和拉普拉斯半径（rLaplace）的竞争关系，成功拟合了松树（Pinus sylvestris）和云杉（Picea abies）的冻结数据。该研究为植物抗冻机制和水分运输稳定性提供了新视角，对理解气候变化下的树木越冬策略具有重要意义。

　　

摘要

负压条件下木质部汁液的冻结机制是植物生理学和相变物理学交叉领域的一个独特科学问题。传统平衡热力学认为，由于冰的密度异常，处于张力下的汁液应比正压下在更高温度下冻结。然而，树木枝条中观察到的现象恰恰相反：随着压力变得更负，冻结温度降低。本研究通过冷台阵列测量了从脱水至不同负压的欧洲赤松（Pinus sylvestris）枝条中提取的汁液样品的冻结点，并与具有相似负压的汁液填充样品枝条的冻结点进行了比较。研究发现，提取汁液的冻结起始点比枝条内部低约10°C，且与提取前存在的水势无关。这些结果强烈表明，张力下的过冷是一个纯粹的物理现象，成核是由木质部组织表面 initiated 的。通过类比气溶胶科学，我们提出导管壁中的孔隙可能形成冰胚或气体纳米气泡，两者之间的竞争决定了宏观冻结点。基于上述机制的唯象模型在实验不确定性范围内重现了观察到的枝条冻结起始温度。

引言

维管植物在亚稳态（称为张力、水势或负液体压力）下对抗重力运输水分。植物茎干中的向上汁液流动已被研究了一个多世纪，现在被统称为内聚力-张力理论（cohesion–tension theory）。处于张力下的水表现出多种异常性质，例如其动力学和热力学量发生反转。例如，托尔曼长度（Tolman length）在负压下被发现为负值，这表明凹面（即气泡）在该区域得以稳定，而不是凸出的液滴。液态水中的声速通常随温度升高而增加，但当水被拉伸时，它首先降低至最小值然后再增加。相反，密度和压缩率在张力下接近最大值。由于实验数据的稀缺，这些曲线的形状（以及所谓的密度最大值线）一直存在争议。事实上，极端负压下水的状态方程仍不清楚，包括可能存在液-液临界点和/或空化前的旋节线分解。

因此，尽管内聚力-张力理论在植物生理学界被广泛接受，但在物理学界仍然存在争议，并且在其无法预测植物汁液与不同物相相互作用的意义上是不完整的。首先，在人工系统中，当水被溶解气体饱和时，无法在负压下维持水力稳定性。它将在比维管植物所达到的压力负得多的压力下沸腾。木质部组织的多孔性，加上脂质涂层纳米气泡的存在，可能有助于对抗不稳定性，但这仍然是推测性的，并且超出了原始内聚力-张力框架的范围。

其次，向上汁液流动对固体冰在树木胞外组织内形成的具体影响 largely 未被探索。由于异质冰形成的随机性，不可能有任何确定性预测冰形成在木质部网络中发生的时间或地点。一些树木组织甚至可以在严寒中保持未冻结状态，因为成核仅受汁液内部条件的概率性影响。例如，人们会期望胞外水的冻结点与其化学组成（即渗透力）以及压力相关。

对于植物霜冻耐受性和越冬领域来说，更准确地量化这些现象极其重要。在寒冷环境中，树木木质部和其他胞外空间中的水通常在冬季结冰。然而，活细胞内部的水（共质体）必须保持未冻结状态，因为冻结将是致命的。一种称为胞外冻结（extracellular freezing）的过程通过将水抽出到胞外质中，增加共质体中溶质的浓度，并降低其冻结点来帮助保护活细胞。尽管有这种保护作用，胞外冻结也可能有害。当水结冰时，溶解的气体会形成气泡，这些气泡可能在解冻过程中膨胀并通过引起栓塞（embolisms）破坏木质部中的水分运输。此外，冰晶形成或活细胞因失水而过度收缩可能导致机械损伤。

在冻结之前，汁液存在于双重亚稳态，即它既过冷低于其熔化温度，又被负压拉伸。换句话说，先前提到的两种相变（栓塞/气泡形成和冻结）在热力学上都倾向于在胞外水中发生。然而它们并没有立即发生，水由于动力学稳定而保持液态。关键是，当它确实冻结时，汁液表现出与其所经历的张力成正比的异质冻结点，与固液相之间的平衡相界趋势相反。提供了新的欧洲赤松枝条冻结点数据。

与大多数材料不同，固态水的密度低于液态水（通常称为“冰的密度异常”）。因此，冰可以在低于0°C时通过压缩熔化。相反，任何 acts to 降低水密度的力（在这种情况下是张力）应将平衡移向固体，提高熔点。

胞外水中过冷随张力增加的反向依赖性已在挪威云杉（Picea abies）和Pistacia integerrima树木以及较小的维管植物如橄榄树和Larrea tridentata中有记载。将我们的枝条冻结数据与Marcolli的参数化以及使用TIP4P/2005水模型的Conde等人的理论预测进行了比较，两者都预测在P < 0时冻结点升高。枝条不仅在该区域表现出冻结对压力的反向依赖性，而且这些点也不在接近零压力时与平衡相界相交。

当然，植物不是平衡系统；它们消耗来自环境的太阳能和化学能。然而，汁液流动通常被认为是一个被动过程，并且木质部导管壁在某种程度上是生物惰性的。甚至已死植物也被证明可以向上运输水分，如Strasberger著名的橡树实验。因此，基础物理学预测汁液冻结应 primarily 由密度异常决定，遵循类似Marcolli的对压力的依赖性，即使冻结起始点转移到过冷状态。

图1还包括了Koop等人基于水活度（a_w）的冻结参数化。活度可以代替施加的外部压力使用，因为可以将水势的相对湿度依赖性（来自内聚力-张力理论）等同于水活度对冻结点的依赖性。我们注意到，当这样做时，线的梯度趋势是“正确的”方向，尽管它仍然不足以捕捉观察到的负压下过冷程度。

我们相信需要一种结合物理学和树木生理学的跨学科方法来应对这个问题。为此，我们从北方树木欧洲赤松的胞外质中提取了水势从零到水力衰竭（hydraulic failure）范围内的汁液样品，并在冷台阵列中体外冷冻它们。目的是测试汁液冻结是否是一个纯粹的物理现象，由木质部导管表面的活性位点 initiated，或者是一个（生物）化学现象（由渗透力或悬浮在液体中的冰核颗粒决定），间接由张力引起。

接下来，通过类比大气中云形成过程中冰在矿物颗粒上的生长，我们开发了一个负压下木质部汁液冻结的唯象模型。它假设导管壁（或导管间纹孔）中的孔隙可能形成冰胚或 seeded 纳米气泡，两者之间的竞争决定了宏观冻结点。该模型依靠经典成核理论（Classical Nucleation Theory）确定前者，依靠杨-拉普拉斯方程（Young–Laplace equation）确定后者。它只需要假设嵌入导管表面的孔隙尺寸的均值和方差即可有效地将模型拟合到观察到的数据。

我们注意到，在挪威云杉的情况下，冻结点在水势 around 枝条木质部组织开始栓塞化的点时趋于平稳并变得与水势无关。为了更准确地捕捉这种行为，我们引入了模型的一个变体，其中亚稳程度被允许每MPa压力发生变化。

基本问题是汁液冻结对压力的反向依赖性是从底层物理过程产生的，还是植物经历的、间接由水势引起的生物变化的结果。我们相信汁液的纯度和汁液上升的被动性质指向物理解释。在这项工作中，我们表明基于所考虑植物水力系统的特征来定量预测树木组织冻结温度是可能的，反之亦然：使用汁液冻结点来推断木质部导管表面的结构。我们将展示气泡形成和冻结之间的竞争对于确定负压下胞外水的相行为至关重要。

材料与方法

欧洲赤松枝条冻结

为了研究枝条水势如何影响其冻结温度，于2023年1月从芬兰赫尔辛基Viikki植物园（60.219978; 25.006782; 海拔10米）采集了欧洲赤松（Pinus sylvestris (L.)）枝条。从10棵个体树中各采集两根约1米长的枝条。所有样品在中午采集，切割下的枝条被带到实验室。

在实验室中，样品枝条在水下重新切割，并在室温下直立放置在一个装满水的桶中过夜，并用黑色塑料袋覆盖以使它们饱和。饱和后，枝条的切割端用胶带密封，枝条在室温条件下 bench-dehydrated 至不同的水势。每天（将枝条保持在完全黑暗后）使用压力室（I505D-EXP, PMS Instrument Co., Albany, OR, USA）从每根枝条的4到6根针叶测量枝条的水势。

实验期间，具有相似水势的成对枝条储存在密封塑料袋中，温度为+5°C，以避免进一步脱水。从这些成对枝条中，随机选择一根用于测试舱中的枝条冻结实验，另一根用于汁液收集。

在枝条冻结实验中，枝条被直立放入测试舱（Weiss Umwelttechnik WK11–340/40）中，分两批（5 + 5根枝条）在同一天进行。T型热电偶附着在树皮表面以检测胞外质冻结期间释放热量的冻结放热（如Lintunen等人所述）。枝条的基部直径从8到12毫米不等，但热电偶附着在所有枝条直径约为6毫米的位置。冻结实验的第一步是将温度从室温快速降至5°C。然后，温度以5°C h^?1的受控速率降至?10°C，并在目标温度下保持2小时。

在汁液收集过程中，枝条从两端在水下重新切割至15厘米长（无侧枝）。从切割端剥去1厘米长的树皮，并在剥皮部分缠绕管道胶带以防止树皮有任何可能的水连接。然后，每个枝条段连接到装满Milli-Q水和藏红染料（以确保我们不收集我们喂给枝条的水）的管子上，并连接到一个提升到1.0米高度的储水器。从切割的枝条尖端渗出的汁液收集在无菌1.5毫升微量管（TreffLab CleanRoom Pure? Microtubes, Degersheim, Switzerland）中，丢弃前1-2滴以避免切割可能造成的污染。十个装有汁液样品的微量管，每个含有1毫升汁液，被运输用于进一步实验。所有程序步骤都戴手套进行，以避免污染样品。

为了获得更多关于在更低水势下枝条冻结的数据，于2024年2月从同一植物园生长的10棵松树采集了另一组20根约1米长的枝条。这些枝条按照前述组相同的方式处理，即饱和、密封切割端、并在测量水势的同时 bench-dehydrated。这次，在达到从接近0到?7 MPa的不同目标水势后，每次随机选择四根样品枝条的子集。然后，四根枝条的组在测试舱中冷冻，用热电偶测量放热。这次，温度从室温快速降至3°C，然后以4°C h^?1的受控速率降至?10°C，并在目标温度下保持2小时。最后，温度也以4°C h^?1的受控速率升回3°C。在测量脱水样品枝条的冻结点后，将枝条重新水化，并在达到目标水势后重新冷冻以再次测量冻结点。由于从相同枝条测量了两次冻结点，使用了比第一组枝条更低的温度变化速率，以避免解冻过程中任何可能的组织改变。

冰核化温度使用RStudio（v.4.3.2）确定为可检测冻结放热发生前5秒记录的温度。

冷台测量

汁液样品从切割的枝条中提取，然后立即从Viikki运输到芬兰气象研究所进行分析。使用Mk-1液滴冻结冷台（Sikora Scientific Instrumentation, Bremen, Germany）分析汁液样品的冻结活性。液滴冻结实验通过将一组49个汁液液滴（1 μl）沉积在置于温度控制冷板顶部的疏水玻璃载玻片上进行。高分辨率相机捕获液滴图像以在降低和记录温度时识别冻结事件。测得温度的不确定性发现小于0.3°C。1 l min^?1的氮气流过液滴以最小化霜的形成。为选定的样品制备了十倍稀释的Milli-Q水。每个样品和稀释液至少分析了100个液滴。在冻结实验期间，冷台温度以1°C min^?1的速率从0°C降至?30°C。作为温度函数的冻结分数 f_ice (T) 直接从图像分析中得出。每毫升汁液的活性位点密度按Vali的方法计算。尽管这里使用的冷却速率远高于材料与方法部分中所述热电偶实验中使用的冷却速率，但我们预计它不会显著影响我们的结果。根据Shardt等人的研究，与0.1°C min^?1相比，1°C min^?1已被发现将使测得的冻结点降低 up to 1度。正如我们将看到的，这远小于我们观察到的汁液和枝条冻结之间的差异。

结果

胞外水中过冷随张力增加的一种可能解释是，它是一种（生物）化学现象，仅间接由负压引起。例如，抗冻蛋白或类黄酮的上调，或电解质浓度的增加。如果是这种情况，效果将是 somewhat 不可逆的；也就是说，即使在正压环境中，汁液冻结仍将显示对其所处水势的依赖性。

我们的结果表明情况并非如此，提取的汁液冻结点与汁液收集时枝条内存在的水势无关：效果不是永久性的。汁液必须保持 under tension 并与木质部表面接触才能表现出任何压力依赖性。汁液和枝条冻结点也直接相互绘制在图S1中，两个实验的完整数据集在表S3中提供。比较的 Pearson 系数（R²）为0.2279，表明相关性低。第二个重要结果是，汁液可以承受的过冷量平均比枝条多10度。

溶解盐离子的渗透压降低了水活度（从而降低冻结点），甚至可以被表达为负压。为了测试渗透对水势和冻结点贡献的大小，将汁液样品浓缩10倍，并重复冷台实验。发现这仅 marginally 将冻结点增加了 <0.5°C。因此，至少在这种情况下，渗透压对水势的贡献不大，我们可以得出结论，汁液表现出足够低的渗透压，以至于无法解释观察到的冻结行为。

相反，将其中一个汁液样品稀释1000倍，将冻结点降低了约5°C，从?14°C降至?19°C。这对应于每毫升汁液的活性位点密度从10²增加到10⁶ ml^?1。这些数字大约比从切割枝条提取的汁液中测量的颗粒数小100倍，并将意味着成核剂的浓度在皮摩尔量级（1.7 × 10^?12 M）。

孔隙冻结参数化

综合来看，该数据集 strongly suggests 木质化木质部网络的壁可能是冬季植物胞外冻结的引发剂。确实，表面科学规定冻结的活性位点通常是几何缺陷或能够在水形成早期阶段与水强力结合的特定化学基团。例如，大气中云形成过程中矿物颗粒上的沉积冻结首先在颗粒表面的孔隙或裂缝中进行，因为液态水和冰临界胚都因楔形几何而稳定。

此外，枝条冻结点对水势的反向依赖性意味着冰核化活性以某种方式被负压的存在抑制。因此，我们提出了一个冻结引发的“Goldilocks”模型，该模型依赖于以下假设：

1. 1.

   木质部导管壁内嵌有大量纳米级楔形孔隙。它们的尺寸分布是对数正态分布。

2. 2.

   冰核化总是在一个孔隙内开始，迅速冻结局部导管，然后在整个木质部的导管网络中扩散。

3. 3.

   一部分孔隙“太大”而无法冻结：它们的隐含半径大于在该水势下稳定的纳米气泡的拉普拉斯半径。因此，它们很可能被周围的负压排空液态水。

4. 4.

   一部分孔隙“太小”：它们的隐含半径小于该温度下的临界冰胚。因此，它们在功能上是壁的一部分，不太可能参与冻结过程。

5. 5.

   剩下的孔隙“刚刚好”：它们处于尺寸分布的亚稳区域，因此具有某种非零的引发冻结概率。

参见图S2，了解这在每个压力步长的尺寸分布上是如何计算的图形表示。注意假设3取决于压力，而假设4取决于温度。更具体地说，拉普拉斯半径 r_Laplace = 2γ_wg / Δp_Laplace 仅通过水-气表面张力 γ_wg 微弱地依赖于温度。这里，Δp_Laplace 是气泡表面的拉普拉斯压力差。相比之下，临界胚半径 r_nucleus = 2γ_iw ν_i / (-Δμ_iw) 仅通过分子体积 ν_i 和冰-水表面张力 γ_iw 微弱地依赖于外部压力。Δμ_iw 是冰相和水相之间的化学势差，等于 k_BT ln(p_wat(T)/p_ice(T))。k_B 是玻尔兹曼常数，p_wat(T) 和 p_ice(T) 分别是水和冰上方的温度依赖性部分蒸汽压（这里使用Marcolli的公式18和19计算）。这些方程定义了亚稳区域的界限，从而定义了系统穿过相图两个轴的路径。

为了初始化模型，还有必要假设最可能冻结的孔隙尺寸是众数尺寸。换句话说，对数正态分布以公式2在 T = T_onset 时的值为中心。一旦初始化，曲线下的亚稳面积 then, by definition, 为50%。

亚稳区域中的孔隙总数 then 应以某种方式与成核率耦合。基本假设是曲线下两个界限之间的面积在每个枝条中应大致相同，至少在观察到冻结的温度下。也可以将平均孔隙半径与第一个压力点处的冰临界半径解耦，允许一个固定但可调的亚稳面积。注意这里的面积指的是尺寸分布中两个半径之间的几何面积，而不是导管表面的物理面积。改变面积的效果显示在图S3a中，从10%到60%，以及固定模式下孔隙尺寸方差的效果显示在图S3b中。

在认为成核率作为压力函数发生变化的情况下，可以以不同模式运行模型：在这种情况下，我们动态地改变亚稳区域的宽度作为负压的函数。就模型的内部功能而言，这意味着 r_nucleus 每MPa压力的减少速率相对于 r_Laplace 要么加速要么减速。

扩大的亚稳区域意味着 r_nucleus 更快地减少，需要更深层次的过冷才能引发冻结。相反，r_nucleus 较慢的减少意味着作为压力函数的 T 减少较慢。我们讨论了这与水力脆弱性（hydraulic vulnerability）之间可能的联系。

我们要 caution that，因为模型是拟合到具有测量水势的枝条，它固有地假设水势在时间和空间上是静态的。这是一个 oversimplification：木质部压力通常显示昼夜动态，单个导管经历 varying 压力，并且水势平均向根部变得负值更小。我们也认为水势的渗透成分可以忽略不计，这可能并非总是如此。

孔隙冻结模型对枝条冻结数据的最佳拟合已针对本工作中收集的欧洲赤松数据（图4a）和来自Lintunen等人的挪威云杉数据（图4b）生成。起始温度允许从其测量值变化±0.5 K，方差 σ² 在0.5到3.0对数单位之间，亚稳性在?5到+4% MPa^?1之间。我们发现，当模型以固定亚稳性模式运行时（蓝线），考虑到数据的 spread，它最初与实验吻合良好，然后在低水势/高负压处向下弯曲，数据在那里趋于平稳。相比之下，可变亚稳性曲线（橙线）紧密跟随两个物种的实验数据。还显示了底层孔隙尺寸分布，绘制在对数刻度上（图4c）。通过比较两个物种，可以看到平均孔隙尺寸大约增加两倍会使起始冻结温度增加1.5度。

讨论

已经提出了几种候选物作为不同植物类型中冻结的引发剂，包括外源性（例如假单胞菌细菌）和内源性（例如花芽中的）成核剂。参见本期Lamacque等人的观点文章以获取更详细的概述。这项工作并不试图表明木质部孔隙是越冬期间冰的唯一成核剂。相反，我们希望提请注意，冻结点随张力减少是冰形成被抑制的一个例子（如图1所示，水势降低2 MPa产生了约3°C的冻结温度降低）。因此，它需要一个“反成核剂”来解释——某种降低成核率并允许在压力变得更负时进入更深层次过冷的东西。

木质部汁液中纳米气泡的存在一直有些争议，尽管其存在的证据一直在增加：它们已在冷冻汁液样品中使用电子显微镜观察到，它们的尺寸和动力学通过纳米颗粒追踪测量，并且它们在负压下的稳定性通过理论计算解释。简而言之，纳米气泡（即尺寸 below 1 μm 的气泡）每当一个栓塞化的导管与一个水填充的导管相邻时就会产生。负压的抽吸力通过挤压使空气通过纹孔膜孔隙。它们在此过程中被脂质涂层，这通过动态表面张力稳定它们免于膨胀，并且由于它们的负表面电荷导致它们相互排斥而免于凝结。一旦夹带，单个气泡无法离开它们所在的导管，但据信气体能够穿过纹孔，在此过程中形成新的气泡。因此，纳米气泡的浓度在靠近栓塞化或切割的木质部区域最大，随着距离增加而衰减。

我们希望强调，本模型中考虑的气泡不是空气 seeding 的结果，就像它们通常通过纹孔膜那样。相反，它们是在楔形几何体内成核（或“脱气”）的，原因与冰成核的原因大致相同：周围的汁液相对于“从壁脱离”是亚稳态的，并且楔形几何催化了成核。因此，产生的纳米气泡不会自由漂浮稳定，并将留在孔隙内。孔隙内液态水的缺失 then 会使其在冰形成方面失活。

相关地，我们假设成核的纳米气泡不会是脂质涂层的，并且它们的界面张力 γ_wg 将简单地是水的界面张力。因此，只需要两个（或三个）参数来拟合实验数据：平均孔隙半径（定义 T_onset），孔隙尺寸分布的方差/标准差（定义线穿过 p, T 空间的斜率），以及可选的每MPa亚稳面积的变化百分比。

经典成核理论胚半径随温度快速衰减，如表1所示，接近约3 nm的渐近线。隐含的平均孔隙半径以与接近零水势的冻结温度相同的方式缩放。此处研究的两个物种的平均孔隙半径的拟合值显示在图例中，欧洲赤松为20.4 nm，挪威云杉为11.1 nm。虽然木质部导管的纳米级结构仍未测量，但这些值与Li等人在纹孔膜中发现的孔隙尺寸（5–20 nm）一致。由于构成纹孔膜的纤维素纤维（Nishiyama等人）在尺寸和形状上与构成木质部壁的木质素纤维相似（它们甚至可以交织，例如在木质纤维素材料中），这是有希望的，并表明导管壁孔隙尺寸可能与纹孔膜值相似。

此外，我们注意到平均孔隙半径大约与两个物种的测量枝条导管半径成比例缩放（Held等人，under review）。因此，可能具有较宽导管的树木将在比具有较窄导管的树木更高的温度下冻结，尽管需要收集更多数据才能明确说明。有趣的是，这与仅考虑与液体接触的表面积时所预期的相反。通常，较大的表面积与体积比会促进相变。相反，这里较小的导管可能包含较小的孔隙，这将需要更过冷的汁液才能引发成核。

阻碍我们模型进一步解释的另一个问题是，目前，木质化导管涂层和纹孔膜的分子结构 largely 未被探索。例如，构成纹孔的纤维素纳米纤维可以根据所考虑的纤维面充当疏水性或亲水性，这是其三维化学结构的结果。它们与水相互作用的纳米级细节，以及因此的冰核化能力，是先验未知的。我们希望，在未来几年，显微镜和分子模拟研究将阐明这些空白。

文献中关于植物中冰核化是单个事件还是多个事件的结果也存在 conflicting 证据。在固定亚稳性模式下，我们的模型假设一个事件迅速在整个木质部网络中扩散。用固定亚稳水平将模型拟合到欧洲赤松数据显示在约?3 MPa处存在偏差，测量的冻结点在那里趋于平稳并变得与压力无关。我们观察到模型和实验的这种解耦发生在两个物种发生水力衰竭的点附近。

一旦水柱失去内聚力，木质部网络分裂成许多独立的水填充导管群，被 otherwise 栓塞化的木材包围。剩余液体中的负压很可能保持在其发生水力衰竭时的值附近。测量的叶水势将继续下降，但它与网络中大部分汁液断开连接。

在这种情况下，需要发生许多独立的（微观）冰形成事件，热电偶才能观察到宏观的潜热释放。因此，我们的模型在固定亚稳性模式下运行不适用于 such a system，并且冻结点在该压力下趋于平稳并不奇怪。

换句话说，我们 suggest that 水力衰竭后的冻结点是多个独立成核事件的结果。可以假设存在与木质部网络中孤立导管群一样多的成核事件——在这种情况下，成核率可能比水柱完整时高几个数量级。因此，它们应由模型在可变亚稳性模式下处理。

结论

据我们所知，这是首次尝试从理论上解释或模拟木本植物体内张力下的冻结。通过从处于一系列张力下的欧洲赤松个体中提取汁液样品，我们发现水势对枝条中冻结点的影响并未转移到提取的汁液中。此外，汁液冻结点也明显更低，低约10度，意味着高纯度（因此渗透力低）。每毫升提取汁液的冰活性颗粒浓度峰值在10⁶ ml^?1，与之前的纳米颗粒追踪测量相比约为1/100。因此，我们的结果表明，冻结起源于冬季耐寒枝条的导管壁或可能是导管间纹孔上。

我们提出了一个所谓的“Goldilocks模型”来解释这一现象：导管表面的活性位点被负压“失活”，如果它们太大则排空其中的水。剩余的位点将以与能够容纳临界胚的孔隙比例相关的概率激活或不激活。我们发现该模型 largely 重现了观察到的欧洲赤松和挪威云杉的冻结点，在水势 up to 两棵树失去木质部导水率的点范围内。在更负的水势下，冻结点似乎趋于平稳，表明了一种 regime，其中多个冻结事件在断开的导管簇中独立发生。

需要进一步的工作来发现该模型是否适用于其他物种观察到的冻结行为，并检查孔隙尺寸的拟合值是否现实。特别是，希望最终可以使用极高空间分辨率的技术（如原子力显微镜）来阐明不同