rDNA多态性陷阱：丛枝菌根真菌物种鉴定中核糖体DNA与蛋白编码基因的比较分析

本综述系统探讨了丛枝菌根真菌（AMF）核糖体DNA（rDNA）存在的显著多态性现象及其对物种鉴定的深远影响。研究通过比较rDNA（SSU/ITS/LSU）与蛋白编码基因（glomalin/RPB1/H+-ATPase）的进化特性，揭示了rDNA高变区（如ITS和LSU）导致的系统发育偏差，并首次提出基于蛋白编码基因的物种界定阈值（glomalin 1%/RPB1 1.1%/H+-ATPase 1.7%）。该研究为AMF分类学提供了分子鉴定新范式，对微生物生态学研究具有方法论意义。

　　

核糖体DNA intragenomic多态性对分类学的影响

丛枝菌根真菌（Arbuscular Mycorrhizal Fungi, AMF）的核糖体DNA（rDNA）存在广泛的多态性现象，这一特征在过去30年间虽被零星报道，但始终未引起生态学和分类学研究的足够重视。通过对Rhizophagus irregularis五个菌株的全基因组数据分析，发现其rDNA拷贝数在不同染色体间呈不均匀分布（9-11个拷贝），且拷贝间平均遗传距离从SSU区域的0.08%到ITS2区域的6.9%不等，其中菌株DAOM 197198的ITS1区域最大差异可达21.1%。单核苷酸多态性（SNP）密度分析进一步证实，这种多态性现象广泛存在于球囊霉科（Glomeraceae）等多个谱系中。

这种多态性对传统分类方法构成严峻挑战。研究显示，当使用不同相似度阈值（97-100%）对rDNA序列进行聚类时，无法获得跨菌株一致的物种划分标准。例如，SSU序列仅能在1%的阈值下实现单簇聚类，而ITS1区域则需要13-21%的菌株特异性阈值。更值得注意的是，在Rhizophagus prolifer和R. intraradices等近缘物种中，高度分化的rDNA拷贝会导致并系群（paraphyletic clades）的形成，从而误导系统发育关系的推断。

PacBio测序技术在rDNA拷贝解析中的应用

为解决rDNA多态性带来的鉴定难题，本研究开发了基于PacBio HiFi测序技术的生物信息学流程。该流程采用自适应聚类算法（swarm algorithm），无需依赖预设的遗传距离阈值，即可从单孢子样本中有效回收rDNA变异序列。通过AML1/wLSUmBr引物组扩增的2.8 kb片段，成功覆盖了分类学研究中常用的Krüger片段（SSU-ITS-LSU）以及生态学研究关注的V3-V4（SSU）和D1-D2（LSU）可变区。

验证实验表明，该流程能从Rhizophagus irregularis菌株中回收4-8个rDNA拷贝，与基因组参考序列的比对一致性达55%（完全匹配）和38%（单碱基差异）。在对44个AMF物种的单孢子测序中，发现不同物种的rDNA多态性程度存在显著差异：Gigaspora rosea的SSU区域最大差异为1.1%，而Vicospora viscosa可达1.5%；Krüger片段的最大变异范围在Cetraspora等属中低于1.3%，但在Gigaspora和Rhizophagus属中可达3-11%。

蛋白编码基因与rDNA的DNA条形码性能比较

通过基因谱系一致性（GCPSR）原则，研究从143个培养物中界定出39个系统发育物种。对三个蛋白编码基因（glomalin、RPB1、H⁺-ATPase）和rDNA区域的DNA条形码分析显示，所有检测位点均不存在明显的条形码间隙（barcode gap）。然而，95%的同种序列在蛋白编码基因中表现出较低的分化度：glomalin≤1%、RPB1≤1.1%、H⁺-ATPase≤1.7%，而Krüger片段的同种差异阈值高达7.9%。

特别值得关注的是，在Rhizophagus irregularis和R. vesiculifer以及Glomus chinense和G. rugosae等近缘种中，rDNA的种内差异甚至超过种间差异（例如R. irregularis种内差异7.7% vs 种间平均差异6.2%）。这种重叠现象使得单纯依靠rDNA序列难以实现准确物种划分，而多基因联合系统发育分析则能清晰解析这些 taxonomic groups 的进化关系。

讨论：方法论启示与分类学实践建议

本研究揭示了AMF rDNA多态性的三个核心特征：跨物种普遍性、位点特异性（ITS/LSU > SSU）和菌株特异性分布模式。这些特征对当前AMF研究实践产生重要影响：首先，基于短读长测序的环境多样性研究可能因rRNA变异而高估物种丰富度；其次，公共数据库中的序列比对可能因部分rDNA拷贝的显著分化而产生错误分类（如Microdominikia litorea的SSU序列匹配错误案例）。

针对这些挑战，研究提出以下解决方案：

1. 1.

   分类学研究应优先选择蛋白编码基因（特别是glomalin和RPB1）作为辅助条形码

2. 2.

   生态学研究建议靶向保守性较高的SSU区域

3. 3.

   建立包含rDNA变异谱的参考数据库（如UNITE/EUKARYOME）

4. 4.

   避免将rDNA序列与蛋白编码基因串联进行系统发育分析

值得注意的是，glomalin基因在本次研究中表现出优异的扩增效率（跨五目AMF）和序列保守性，且不存在内含子干扰，使其成为极具潜力的标准条形码候选。而H⁺-ATPase基因在Gigasporaceae中存在旁系同源拷贝，不适合作为通用条形码。

结论与展望

本研究系统论证了AMF rDNA多态性对物种鉴定的深刻影响，并建立了整合PacBio测序与生物信息学分析的标准化流程。研究结果表明：

1. 1.

   单一遗传距离阈值不适用于AMF的rDNA基于物种划分

2. 2.

   蛋白编码基因（glomalin/RPB1）提供更可靠的物种界定标准

3. 3.

   建立规范化的rDNA变异数据库是改善序列鉴定的关键

未来研究需重点突破三个方向：开发跨AMF谱系的通用蛋白编码基因引物、建立整合多基因信息的分类学框架、探索rDNA多态性的进化驱动机制。这些工作将推动AMF分类学从形态-分子混合范式向多基因组学范式转变，最终实现环境样本中AMF群落结构的精准解析。