细胞色素c与复合体III间长程电荷传输新机制：质子与活性氧介导的生理调控

本研究发现细胞色素c（Cc）与复合体III（Cc1）间存在超越经典电子隧穿距离的长程电荷传输现象，通过电化学扫描隧道显微镜（EC-STM）技术证实该过程由质子（H+）和超氧阴离子（O2?·）介导，并受pH值、氘代水（D2O）及氧气浓度调控。研究揭示了呼吸链中质子耦合电子转移（PCET）的新型调控机制，为理解线粒体能量转换与氧化应激提供了新视角。

　　

引言

电荷传输在生物系统中通过氧化还原蛋白间的连续电子转移（ET）事件实现，是维持生命的呼吸作用和光合作用电子传递链的核心过程。虽然蛋白质内电子转移已得到深入研究，但由于溶剂存在及蛋白质相互作用的瞬时性，蛋白质间电子转移的研究仍面临挑战。通过将精确取向的氧化还原蛋白对连接到电化学扫描隧道显微镜（EC-STM）的纳米电极上，可以记录它们之间电流的时间与距离依赖性。这些方法揭示了单个蛋白质对间的电流延伸超越隧穿距离，并受电化学门控调控，但其机制及水溶液中的电荷载体身份尚待阐明。

研究方法与结果

本研究通过EC-STM技术，在特定电位下测量细胞色素c（Cc）与其呼吸链氧化还原伴侣蛋白Cc₁（细胞色素bc₁复合体的可溶性结构域）间的电流-距离（I-z）关系。实验在50 mM磷酸缓冲液中进行，pH范围6.6–8.0，以考察质子浓度的影响。Cc和Cc₁分别固定在EC-STM的探针和样品电极上，通过断开反馈回路并以恒定速度（12 nm·s^?1）回撤探针记录电流衰减。

在pH 6.6条件下，Cc-Cc₁间观察到长达10 nm的电流传输（衰减因子β = 0.6 ± 0.3 nm^?1），显著低于金电极间相同溶液中的β值（≈10 nm^?1）。随着pH升高，电化学门控效应减弱，β值增加至1–2 nm^?1，表明质子参与传输过程。使用氘代水（D₂O）在pD 6.9条件下进行实验，发现电流衰减更陡（主峰β = 0.9 ± 0.3 nm^?1），并出现两个新组分（β = 2.4 ± 0.4 nm^?1和6 ± 2 nm^?1），动力学同位素效应（KIE）在1–10 nm距离范围内达到1.3–20，证实质子质量对传输效率的影响。

通过电流-时间（I-t）"闪烁"测量，发现在D₂O中Cc-Cc₁互作形成更稳定的连接（寿命40 ms vs 30 ms），并出现两个等概率电导种群（2.4·10^?6 G₀和8.9·10^?6 G₀），而H₂O中主要电导为4.3·10^?6 G₀。这表明D₂O改变了蛋白质骨架灵活性及氢键形成倾向。

对Cc氧化态和还原态结构的pK_a计算（使用H⁺⁺和PropKa3.5）发现，Lys13、Tyr46、Lys79和Asp93四个残基的质子化状态与蛋白质氧化还原状态相关（差异>1 pH单位），这些残基位于血红素活性位点周围2 nm范围内，形成可切换氢键网络的离子化位点，支持质子耦合电子转移（PCET）反应。

在低氧浓度条件下（溶液脱气处理），电流空间跨度减小（β = 1.9 ± 0.8 nm^?1），随时间延长逐渐恢复，表明氧气或其活性氧（ROS）副产物参与长程电荷传输。超氧阴离子（O₂^?·）作为稳定带电载体，可在Cc与Cc₁间交换电子，并沿Gouy-Chapman导流（GCC）电场漂移。

讨论

本研究通过不同pH、D₂O环境及氧浓度下的ECTS测量，鉴定出质子和超氧阴离子作为Cc与Cc₁间水溶液长程电荷传输的载体和/或介质。Cc已知具有氧依赖性氧化还原活性，可作为超氧阴离子的电化学传感器。超氧阴离子通过直接氧还原产生（O₂ + e^? → O₂^?·, -0.54 V vs SSC），在生理条件下作为"沉默介质"通过无效氧化还原循环介导电子传输。

质子通过Grothus质子跳跃机制沿GCC电场传输，其效率在酸性至中性pH条件下增强。PCET反应通过Cc中识别出的离子化残基网络（如His18、Tyr46、Tyr48、Lys79等）实现，这些残基的氧化还原依赖性pK_a变化可调节与水的氢键形成能力。较大的KIE值表明强质子-电子耦合，可能涉及氢原子转移和质子隧穿机制。

这些发现揭示了Cc与Cc₁在实验条件下通过水溶液传输pH和氧依赖性长程电流的内在能力。蛋白质间通过溶液进行远距离电荷传输不仅能减少相互作用力和持续时间，还能通过局部环境暴露使其受到多种生物学调控方式的影响。质子与超氧阴离子作为呼吸链酶的重要反应物和副产物，其局部浓度与电子传输速率耦合，为细胞在相关环境情况下提供"电化学反馈"的直接稳态调节机制。

结论

通过系统研究pH、D₂O和氧浓度对Cc-Cc₁间电荷传输的影响，结合氧化还原依赖性pK_a计算，本研究证实水溶液中的长程电流由质子和超氧阴离子辅助完成。这些发现为理解呼吸复合物中电子转移提供了新的分子机制见解，并对生物能量转换和氧化应激调控具有重要启示意义。