集成式微流控平台实现秀丽隐杆线虫（C. elegans）长时程成像、功能分析与下游蛋白质组学的单个体分辨率研究

本刊推荐一项突破性微流控技术研究，该工作开发了一种集成式平台，支持对秀丽隐杆线虫（C. elegans）从L1幼虫期至成虫的连续高分辨率成像，具备动态流体控制、自动营养供给与废物清除功能，并实现了非侵入性短暂固定。该系统可用于应激反应监测（如sod-3p::GFP报告基因）、病原体动态追踪（如Pseudomonas aeruginosa PemB毒素）及单线虫蛋白质组学分析，为发育生物学与感染模型研究提供强大工具。

　　

设备设计与工作原理

该研究的核心是开发一种多层微流控芯片，由聚二甲基硅氧烷（PDMS）制成的控制层与流动层构成。系统包含20个独立单元，支持对最多20只线虫从L1阶段到成虫的并行培养与监测。设备集成多种功能阀体，包括进样阀、共同出口阀、营养供给阀、固定阀与分割阀。其中固定阀和分割阀设计为筛网阀结构，可部分关闭，实现基于尺寸的分离，从而完成连续清洗、营养供给、废物清除与后代移除。

设备通过气动压力实现线虫的机械固定，适用于成像期间的非侵入性短暂固定。每个单元内设有微通道网络，支持营养物质（如OP50大肠杆菌）的持续灌注与代谢废物的清除，构成动态自维持的微环境。该设计不仅保证线虫的正常生长与繁殖，还为其提供了一致的方向控制，有利于高通量成像与表型分析。

线虫维持与生长验证

研究通过将N2品系线虫在L1阶段加载至设备，并以恒定流速（1 μl·hr^?1）灌注含OP50细菌的M9培养基，验证线虫在芯片内的正常生长与发育。线虫经历L1、L3、L4阶段最终进入成虫期，并在3天后在设备内产卵。此外，通过使用表达pGFPuv的DH5α大肠杆菌作为食物源，在线虫肠道中检测到荧光信号，证实线虫成功摄食并消化细菌。这些结果表明，该微流控系统能够支持线虫完整生命周期的不间断监测。

应激分析：SOD-3p::GFP报告基因的应用

为评估机械固定对线虫生理状态的影响，研究采用sod-3p::GFP转基因品系（CF1553），该品系通过DAF-16/FOXO3转录因子激活反映应激状态。实验设置两组：对照组仅在接受成像时进行短暂固定（2–5分钟），实验组则持续固定24小时。结果显示，长时间固定导致GFP信号显著增强，而对照组无显著变化。这表明短暂固定不会诱发可检测的应激反应，适合长时间实验；而持续固定则明显激活线虫的应激通路。

饥饿应激模型的建立

在线虫饥饿模型中，研究比较了持续喂食组与饥饿处理组（使用无细菌M9培养基灌注48小时）中sod-3p::GFP的表达变化。饥饿组线虫显示GFP信号显著上升，与充分喂食组形成鲜明对比。该结果不仅验证了芯片内应激模型的可行性，也突显了该平台在动态环境调控与应激响应监测方面的优势。

实时蛋白质定位分析

研究进一步展示了该平台在宿主-病原体互作研究中的应用。通过喂食线虫两种不同Pseudomonas aeruginosa菌株：一组为PA14Δ3tox空载体对照，另一组为表达mCherry标记PemB毒素的PA14Δ3tox/pemB菌株，利用荧光成像（488 nm与640 nm通道）追踪毒素在虫体内的时空分布。这项实验实现了对病原体毒素动态递送与定位的可视化，为感染机制研究提供了宝贵工具。

单线虫蛋白质组学分析的可行性

该研究还探索了微流控平台与单线虫蛋白质组学分析的结合。通过从单个线虫中提取蛋白质，并进行质谱（MS）分析，成功鉴定出80多种秀丽隐杆线虫蛋白质，尽管存在大量大肠杆菌背景蛋白的干扰。这一工作为在单个体水平开展蛋白质组学、转录组学分析奠定基础，有望揭示群体研究中被掩盖的生物异质性。

讨论与展望

该微流控平台在长时程线虫培养、成像与分析方面展现出显著优势：它不仅实现了从幼虫到成虫的连续监测与高分辨率成像，还整合了自动化的流体控制与后代管理功能，减少人工干预需求。与既往技术相比，该设备在维持线虫生理状态、兼容多种生物学实验（如应激响应、病原体感染、分子 profiling）方面具有明显先进性。

尽管该系统的多层气动控制结构具有一定技术门槛，但其模块化设计与可扩展性为未来技术优化与广泛应用提供可能。此外，该平台的成功开发也为其他模式生物（如斑马鱼、果蝇）的微流控研究提供了有益借鉴。

总之，这项研究提供了一种高度集成、功能全面的微流控工具，能够无缝结合发育监测、生理学分析、感染模型与分子 profiling，为发育生物学、神经科学及宿主-病原体互作等领域的研究提供了强有力的技术支撑。