合成益生菌用于原位递送抗SARS-CoV-2纳米抗体的构建：一种新型COVID-19预防策略中文标题

本研究针对SARS-CoV-2病毒入侵机制，开发了一种基于乳酸乳球菌的表面展示系统，用于递送抗病毒纳米抗体。研究人员通过基因工程改造益生菌，使其表面表达特异性纳米抗体，有效阻断病毒刺突蛋白与宿主ACE2受体的结合。实验证实该工程菌能显著抑制假病毒感染，抑制率超50%，为COVID-19的黏膜预防提供了创新性生物治疗策略。

　　

新型冠状病毒SARS-CoV-2引发的COVID-19疫情全球大流行，凸显了开发高效治疗与预防手段的紧迫性。尽管疫苗研发取得显著进展，但针对持续感染和再发感染的抗病毒疗法仍不可或缺。病毒入侵宿主细胞的关键步骤在于其刺突蛋白（Spike protein）的受体结合域（RBD）与人类血管紧张素转换酶2（hACE2）受体的相互作用。阻断这一相互作用成为预防和治疗COVID-19的重要策略。

近年来，纳米抗体（Nanobodies, Nbs）作为单克隆抗体的替代方案受到广泛关注。纳米抗体是骆驼科动物重链抗体中的单可变区（VHH），具有分子量小、亲和力高、稳定性强和易于基因工程改造等优势。然而，纳米抗体在体内易被降解，限制了其直接应用。因此，开发能够保护并高效递送纳米抗体的系统成为研究重点。

细菌递送系统为这一问题提供了创新解决方案。合成生物学改造的细菌能够在特定部位持续合成并释放治疗性蛋白，增强疗效的同时减少系统性副作用。益生菌乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）作为人类共生菌，具有非侵入性、非定植性和“公认安全”（GRAS） status，被FDA批准为食品添加剂。其可通过基因修饰展示外源蛋白，并通过表面展示技术将目标蛋白锚定在细胞表面，避免降解。

本研究旨在构建一种基因工程乳酸乳球菌，表面展示抗SARS-CoV-2纳米抗体，以阻断病毒RBD与hACE2的相互作用，为COVID-19预防提供新型治疗工具。

研究方法

研究采用乳酸乳球菌NZ3900菌株，通过分子克隆技术构建了8种表面展示载体。载体设计包含以下元件：nisin诱导启动子（NICE?系统）、Usp45信号肽（用于蛋白分泌）、FLAG标签、抗SARS-CoV-2纳米抗体（H11-D4或H11-H4）、连接肽（可选）和锚定蛋白cAcmA（用于表面附着）。通过免疫荧光显微镜（无透化处理）和流式细胞术验证纳米抗体在细菌表面的表达；Western blot检测蛋白表达和分泌；ELISA和免疫荧光实验评估纳米抗体与RBD的结合能力；假型慢病毒中和实验测定工程菌对病毒感染的抑制效果。

研究结果

构建基因工程乳酸乳球菌

研究人员成功构建了8种重组质粒，分别组合了不同纳米抗体（H11-D4或H11-H4）、连接肽存在与否以及信号肽增强子（OmpA）存在与否。Western blot结果显示所有构建体均能表达FLAG标签纳米抗体，且信号肽切割后的成熟蛋白证实了蛋白分泌。免疫荧光和流式细胞术显示纳米抗体定位于细菌表面，其中pNZ8149_PLA菌株的荧光强度最高。

纳米抗体与RBD的结合能力

ELISA实验表明，pNZ8149_PLA菌株能剂量依赖性地结合RBD，在1.6×10¹⁰ CFU时结合效果显著高于对照组。免疫荧光实验进一步证实了RBD与工程菌的结合。

抑制RBD与hACE2的相互作用

假型慢病毒中和实验显示，pNZ8149_PLA菌株能抑制病毒感染，抑制率超过50%，且效果略优于无纳米抗体的乳酸乳球菌。实验还发现乳酸乳球菌本身具有一定的病毒抑制能力，可能与其天然特性有关。

讨论与结论

本研究首次利用乳酸乳球菌表面展示抗SARS-CoV-2纳米抗体，证实了该工程菌能有效结合病毒RBD并抑制其与hACE2的相互作用。尽管乳酸乳球菌本身具有一定的抗病毒效果，但纳米抗体的引入进一步增强了抑制能力。研究为开发基于益生菌的黏膜疫苗和治疗方法提供了新思路，尤其适用于呼吸道和胃肠道等病毒入侵的主要部位。

未来研究需优化纳米抗体的表面展示效率，例如采用不同长度的锚定蛋白或选择更高亲和力的纳米抗体。此外，需评估NICE?系统在人体中的稳定性和安全性，以及工程菌的定植能力和持久性。

该研究成果发表于《Probiotics and Antimicrobial Proteins》，为COVID-19及其他病毒性疾病的预防和治疗提供了创新性生物治疗策略。