基于玻璃基底数字光固化3D打印技术的卒中患者特异性颈动脉芯片实现个性化血栓研究

本综述创新性地提出了一种基于玻璃基底数字光处理（DLP）3D打印的超快速微加工平台，能够将患者CT血管造影（CTA）数据转化为解剖结构精确的颈动脉芯片（Carotid Artery-on-a-Chip）。该技术将制造时间从超过10小时缩短至2小时以内，成功率接近100%，并成功保持了血流动力学参数（如壁面剪切率）的生理相关性。平台支持内皮化和血液灌注，结合激光消融技术可实现患者特异性易损部位的精准内皮损伤建模，为个性化血栓机制研究和抗血栓药物筛选提供了突破性工具。

　　

引言

颈动脉，特别是其颈内分支，在急性卒中病理生理中的作用仍然是一个复杂且多方面的挑战。当前诊断工具如计算机断层扫描血管造影（CTA）虽能识别卒中后的血管异常，却难以揭示血栓形成的动态过程。这些成像方法提供了有价值的解剖和血流快照，但缺乏准确评估Virchow三联征（血流改变、内皮损伤和血液凝固性增加）相互作用所需的分辨率和功能特异性。

近年来，基于数字光处理（DLP）的微精度3D打印为创建复杂的血管芯片设备开辟了新可能性。这项技术能够直接制造具有高分辨率和快速处理时间的3D结构。然而，将患者特异性血管成像数据转化为功能性微流体设备，同时在微观尺度上保持解剖精度仍然具有挑战性。

研究方法与成果

快速原型与优化

研究团队开发了一种创新、超快速且高精度的制造系统，用于生产患者特异性颈动脉芯片。他们采用BMF S240型DLP 3D打印机，能够构建适用于微流体测试的详细颈动脉模型。该过程从提取三名临床诊断为卒中的患者的CTA颈动脉图像开始，将这些图像精确缩小至颈总动脉管腔直径为200-300μm，使其与微流体应用兼容。

通过采用定制的表面平滑算法结合手动细化，该方法保留了关键的解剖特征，特别是在病变区域精确复制狭窄和溃疡对于准确建模至关重要。重建的血管几何结构随后沿中间轴向平面分成两半，以促进其转化为功能性微流体设备。

该团队开发了一种机械夹具系统，旨在防止芯片处理和操作过程中潜在的泄漏和分离。优化后的制造方法将每个模具的制造时间显著减少至不到2小时，成功率高达≈100%，使该过程具有可扩展性，非常适合生产用于血栓评估的高保真颈动脉模型。

流体流动特性表征

该研究的基础在于准确复制患者特异性血管几何结构。通过CTA图像增强，提供了动脉解剖结构的详细可视化。研究发现，大多数现代CT扫描仪提供的自动3D重建过程通常无法捕捉血管腔的关键细节，特别是在存在溃疡或复杂狭窄的情况下。

通过与经验丰富的神经学家合作，团队开发了精细的3D重建方法，确保了颈动脉分叉3D结构的精确描绘，这是颈总动脉（CCA）分为向大脑供血的颈内动脉（ICA）和向面部供血的颈外动脉（ECA）的关键区域。

通过计算流体动力学（CFD）分析，研究团队确认了微流体尺度与患者体内CTA尺度之间的血流动力学可比性。这些分析对于绘制剪切率分布至关重要，这是血栓发展的关键血流动力学因素。研究发现所有患者的峰值剪切率均超过1000 s^-1，表明存在病理性血流动力学条件，而健康颈动脉中的剪切率约为400 s^-1。

内皮化与生物功能化

为了进一步增强颈动脉芯片的生理相关性，研究团队实施了全面的内皮化和生物功能化方案。该过程从微流体通道的制备开始，首先用纤维连接蛋白涂覆通道，随后在微流体通道内接种人脐静脉内皮细胞（HUVEC）以模拟人体血管壁。

通过采用已建立的倒置技术，研究实现了整个通道表面的均匀内皮化。接种后15分钟，小心倒置颈动脉芯片，使细胞能够粘附到通道的所有表面，包括上壁。经过一夜孵育后，观察到融合的内皮细胞单层形成，通过CD31染色证实。

通过用肿瘤坏死因子-α（TNF-α）刺激内皮细胞，研究团队评估了内皮化颈动脉芯片的生物功能性。TNF-α暴露显著增加了E-选择素和细胞间粘附分子1（ICAM-1）的荧光强度，显示了该模型对炎症刺激的稳健反应及其在研究血管炎症方面的潜力。

全局血栓形成的表征与调节

针对一名患有70%狭窄但通过成像没有局部血栓证据的患者，研究团队重点研究了整个血管芯片上的血栓反应。为了模拟这种"全局"血栓状况并加速血栓事件，研究团队通过内皮化的颈动脉芯片灌注了用10 mM CaCl₂再钙化的枸橼酸化人血液。

观察到微流体通道内血小板和纤维蛋白沉积的时间依赖性增加，在10分钟时出现显著积累。与内皮细胞合并的图像显示，血栓形成主要发生在颈动脉芯片的分叉处。定量分析证实了这些定性观察结果，显示血栓形成随时间显著增加。

研究团队利用该芯片的药物测试能力，评估了各种抗凝和抗血小板药物在减少全局血栓形成方面的功效。与单独再钙化测试的血液相比，所有三种测试的抗凝剂（克赛、利伐沙班和阿哌沙班）都显著减少了纤维蛋白形成。抗血小板药物表现出不同的血栓抑制模式，替罗非班、PGE1和PGI2有效阻断了血小板聚集和纤维蛋白形成，在该全局血栓模型中展示了 potent 的抗血栓效果。

激光消融损伤与局部血栓建模

研究团队开发了一种将激光诱导损伤与患者特异性颈动脉芯片平台相结合的方法，用于研究局部血栓形成。该方法采用了传统上在动物模型中使用的激光损伤技术，将其适应于具有人类细胞和患者特异性几何结构的微流体环境。

通过采用多模态成像方法，研究团队确定了患者血管损伤部位。CTA图像用于定位患者颈动脉中的纤维钙化和潜在溃疡部位，这些部位在血管腔内显示为异常球状区域。数字减影血管造影（DSA）通过显示血液渗透到血管壁的区域，进一步精确了定位。

将这些临床观察结果转化到颈动脉芯片上，研究团队使用共聚焦显微镜可视化CD31染色的内皮细胞并定位激光消融目标。这种方法使他们能够创建模拟在患者中观察到的损伤。激光消融后，在损伤部位观察到血小板串的形成，展示了该模型的生理相关性，为了解血栓形成的早期阶段和内皮损伤的关键影响提供了见解。

讨论与展望

该研究介绍了一种基于卒中患者CTA图像快速微加工患者特异性颈动脉芯片的新方法，为脑血管血栓形成提供了一个动态且迄今为止更准确的模型，解决了当前基于静态图像的诊断方法的关键限制。研究结果将血栓事件分为全局性和局部性血栓形成，提供了对血栓过程更细致的理解。

使用经过处理的玻璃载玻片作为打印基底代表了一项关键创新，消除了对笨重基座的需求，并将打印时间从超过10小时 dramatically 减少到约2小时。这种修改，结合定制的定位器系统，确保持续高保真复制复杂血管特征，同时提高了制造效率。双材料夹持方法进一步解决了多层微流体设备中常见的泄漏挑战，为在实验过程中保持结构完整性提供了稳健解决方案。

激光消融协议重新创建了血栓性卒中的近端触发因素——斑块破裂和内皮损伤。通过将消融定位到通过CTA/DSA确定的患者特异性溃疡部位，并结合个体化流动条件，可以评估斑块破裂的"假设"情景，这些情景在体内 otherwise 无法测试。这种方法揭示了在破裂事件后患者特异性对血栓栓塞的易感性，填补了当前主要依赖解剖测量的风险分层中的关键空白。

研究还揭示了局部血栓形成中聚集血小板的移位受剪切率分布的影响。血小板聚集最初发生在低剪切区（<1000 s^-1），并生长到高剪切区（>1000 s^-1），移位可能在此启动。定量分析显示高剪切区（>1000 s^-1）的移位密度约高7-10倍，为了解剪切依赖性栓塞风险提供了机制性见解。

在内皮损伤部位观察到的移位事件突出了血栓栓塞中一个潜在的重要机制，表明即使在狭窄水平低于临床干预阈值的血管中，改变的血流动力学区域也可能 harbors 显著的血栓风险。这一发现可能对理解为什么一些 apparently "低风险"狭窄患者仍然发生卒中具有重要意义。

实验方法

该研究使用了从Lonza Bioscience购买的人脐静脉内皮细胞，并在EGM-2 BulletKit培养基中培养直至80%-90%融合。抗体包括抗CD31 Alexa Fluor 488、CD41冻干抗体、抗人纤维蛋白抗体等。所有血液收集均获得悉尼大学人类研究伦理委员会批准，供体提供书面知情同意。

患者选择基于皇家阿尔弗雷德医院记录的颈动脉相关卒中病例，总共从三名患者中提取了五个颈动脉几何结构。临床数据根据悉尼当地卫生区人类研究伦理委员会批准的伦理指南和患者同意协议收集。

高分辨率CTA图像使用通用电气Optima CT660 CT扫描仪获取，图像以0.625mm的切片厚度和0.539×0.539mm的像素间距获取，提供颈动脉结构的详细可视化。获取的CTA图像经过处理，准备进行3D重建和分析。

在微流体芯片制造过程中，使用铝框架标准化芯片的形状和厚度。PDMS混合物倒入该框架中，脱气并在70°C的烤箱中固化2小时。打孔入口和出口以适应流动实验。使用Formlabs 3D打印机设计机械夹具系统。

对于实时血栓形成可视化，使用奥林巴斯FV3000RS共聚焦显微镜和10× UPlanXApo物镜进行实时成像。焦平面设置在血管腔底部上方30μm处。为了研究局部血栓形成，将激光损伤模型与颈动脉芯片平台集成。RAPP UGA-42 Caliburn激光消融模块与共聚焦显微镜系统耦合。

所有实验均进行三次重复，除非另有说明。数据以平均值±标准误差表示。使用未配对Student's t检验确定两组之间比较的统计显著性。p值<0.05被认为具有统计显著性。所有统计分析均使用GraphPad Prism 9软件进行。

扫描电子显微镜使用台式Phenom XL扫描电子显微镜在干燥和固定的非金涂层样品上进行。图像在600-11000×放大倍数下在低真空条件（60Pa）下使用配置有工作距离约3.2mm在5keV的全背散射检测器获取。