BLOC1S1通过空间限制TDP-43抑制布鲁氏菌16M LPS诱导的自噬

本文揭示了BLOC1S1（溶酶体相关细胞器生物发生复合体1亚基1）在布鲁氏菌感染中的新型调控机制。研究发现，布鲁氏菌16M脂多糖（LPS）通过激活AMPK信号通路诱导自噬，而BLOC1S1过表达通过结合并滞留TDP-43于细胞质，抑制其核转位依赖的ATG7 mRNA稳定性，从而削弱自噬流。这一发现不仅深化了对宿主-病原体互作的理解，还为布鲁氏菌病及TDP-43相关神经退行性疾病提供了潜在治疗靶点。

　　

布鲁氏菌感染下调山羊睾丸中BLOC1S1的表达

布鲁氏菌病是由布鲁氏菌属（Brucellaspp.）引起的重要人畜共患病，造成严重经济损失。布鲁氏菌作为革兰阴性胞内病原体，根据脂多糖（LPS）O链的存在与否分为光滑型和粗糙型。感染后，布鲁氏菌通过毒力因子在巨噬细胞内存活，并通过血行播散至多组织，采取兼性且隐匿的胞内生活方式，持续造成宿主损伤。

研究发现，布鲁氏菌感染利用宿主的内质网应激传感器IRE1α的核酸内切酶活性，激活调控性IRE1依赖性衰减（RIDD）途径，降解宿主mRNA，其中包括线粒体自噬受体NIX和编码BLOC1S1的Bloc1s1mRNA。BLOC1S1作为BLOC-1相关复合体（BORC）的亚基，调控溶酶体运输，其降解减少了溶酶体与布鲁氏菌含液泡（BCVs）的融合，从而促进胞内细菌增殖。

通过维恩分析RIDD相关基因和布鲁氏菌下调转录本，发现Bloc1s1和Pmp22是主要候选基因。组织病理学分析显示，感染布鲁氏菌的睾丸组织表现出生精小管结构紊乱、纤维化重塑和空泡化。透射电子显微镜（TEM）显示感染细胞内溶酶体数量显著增加。免疫荧光（IF）证实感染生精小管中BLOC1S1表达显著下调，mRNA和蛋白检测也发现BLOC1S1表达显著降低。这些结果表明布鲁氏菌感染破坏睾丸稳态并抑制BLOC1S1表达，从机制上将溶酶体失调与细菌存活增强联系起来。

BLOC1S1过表达提升mGSCs-I-SB中溶酶体相关基因表达

基于观察到的BLOC1S1下调，研究在山羊精原干细胞（mGSCs-I-SB）中过表达BLOC1S1（oeBLOC1S1）。BLOC1S1过表达未引起mGSCs-I-SB形态学变化，但证实mRNA表达上调九倍，蛋白增加1.6倍。RNA测序分析显示oeBLOC1S1细胞中1593个基因上调，1440个基因下调。

聚焦于与BLOC1S1功能作用一致的溶酶体通路，发现溶酶体相关基因（CTSL、LAMP2、CXCR2、C3、RAB20、PLBD1和NKG7）显著上调，而MTOR（TBF2核转位的关键调控因子）表达下调。实时定量PCR（qRT-PCR）获得类似结果。KEGG通路分析突出显示HIF-1信号、PI3K-AKT信号和TNF信号通路富集。GO术语分析将差异基因与核糖体、核仁、细胞质和胞质溶胶功能关联。这些数据表明BLOC1S1过表达驱动mGSCs-I-SB细胞向溶酶体激活的转录重编程。

布鲁氏菌16M LPS在mGSCs-I-SB中诱导AMPK依赖性自噬

为模拟布鲁氏菌感染，用16M LPS处理mGSCs-I-SB。初步时间进程实验确定1-2小时为炎症基因诱导高峰时段。基于24小时感染后BLOC1S1下调的证据，选择24小时进行后续测定。剂量反应分析显示在1000 ng/mL LPS时TLR4、IL-1β、TNF-αmRNA表达最高，确定为最佳浓度。

与大肠杆菌（E. coli）LPS比较，16M LPS特异性上调对照组细胞中的促炎（PYCARD、CXCL1、IL-18和IRF3）和溶酶体（LAMP2、DNTPB1）基因，在oeBLOC1S1细胞中诱导部分减弱。相反，E. coliLPS未显示显著转录激活。流式细胞术证实两种LPS类型在对照或oeBLOC1S1细胞中均未诱导凋亡。

蛋白质组分析显示16M LPS上调DDX5、NF-κB和IL-6，同时降低磷酸化NF-κB（p-NF-κB）和IL-6 ST。相反，E. coliLPS抑制DDX5、IL-6和IL-6 ST表达。LAMP2上调和LC3B-II/LC3B-I比率增加证实16M LPS诱导自噬。机制研究使用AMPK抑制剂多索吗啡（Dorsomorphin）处理消除AMPK磷酸化和自噬激活，确认AMPK依赖性。重要的是，AMPK抑制逆转了LPS诱导的BLOC1S1下调，确立AMPK激活是BLOC1S1抑制的上游驱动因子。这些结果表明16M LPS在mGSCs-I-SB中驱动AMPK介导的自噬流，同时反向调控BLOC1S1水平。

BLOC1S1过表达减弱16M LPS诱导的自噬激活

为阐明BLOC1S1在16M LPS触发自噬中的调控作用，进行超微结构、GFP-mCherry-LC3串联荧光分析和分子分析。TEM证实16M LPS处理显著增加对照组（CAG）细胞中自噬样囊泡（自噬体和自溶酶体）形成，而oeBLOC1S1细胞显示自噬空泡化减少。

GFP-mCherry-LC3串联构建作为监测自噬流的可靠工具。在该系统中：黄色斑点（GFP⁺ mCherry⁺）指示自噬体，红色斑点（GFP^? mCherry⁺）代表自溶酶体。这种区分源于酸性溶酶体环境中GFP荧光淬灭而mCherry保持稳定。因此，用GFP-mCherry-LC3质粒转染CAG和oeBLOC1S1细胞显示，CAG细胞在16M LPS处理下红色斑点显著增加（p< 0.001），黄色斑点无显著升高，而oeBLOC1S1细胞与未处理对照相比自溶酶体（红色斑点）未增加。

16M LPS上调CAG细胞中自噬相关转录本（LAMP1、LAMP2、LC3、BECN1和UVRAG），在oeBLOC1S1细胞中诱导显著减弱。并行蛋白水平分析显示oeBLOC1S1细胞中LC3B-II/LC3B-I比率低于16M LPS处理对照组。同时，使用巴佛洛霉素A1（BafA1）抑制溶酶体酸化和自噬流。CAG细胞经16M LPS处理显示LC3B-II/LC3B-I比率升高，而oeBLOC1S1细胞比率低于CAG处理组。尽管由于组内变异大未达到统计学显著性（p> 0.05），但方向趋势在所有实验重复中一致。

上游调控因子机制分析显示BLOC1S1过表达抑制基础p-PI3K、p-AKT和ULK1水平。虽然16M LPS部分恢复这些磷酸化信号，但AMPK/p-AMPK保持不变。重要的是，LPS诱导的mTOR上调（可能与氧化应激响应相关）在oeBLOC1S1细胞中减弱。这些数据表明BLOC1S1介导的自噬调控独立于经典PI3K/AKT-mTOR-ULK1或AMPK-ULK1通路。同时，16M LPS诱导的促炎介质（DDX5、IL-6、IL-6 ST和NF-κB/p-NF-κB）在oeBLOC1S1细胞中减弱。

通过氧消耗率（OCR）测定进行代谢分析，进一步证明oeBLOC1S1细胞中线粒体功能增强，表现为基础呼吸、ATP链接呼吸、最大呼吸能力和备用呼吸能力升高。

通过DIA蛋白质组学系统探索BLOC1S1过表达对16M LPS诱导细胞响应的调控机制。主成分分析（PCA）显示CAG-NC组和CAG-16M LPS组沿PC1轴（贡献率20.24%）清晰分离。oeBLOC1S1细胞（oeBLOC1S1-NC和oeBLOC1S1-16M LPS）在PCA空间中与CAG组明显分离，组内重复性高，表明BLOC1S1可能通过稳定特定蛋白网络调控炎症响应。

GO富集分析进一步显示BLOC1S1过表达显著调控生物过程包括“核小体组装”和“抗原加工/呈递”，以及分子功能相关“细胞氧化还原稳态”，暗示其在表观遗传调控和免疫微环境重塑中的潜在作用。“核小体组装”富集表明BLOC1S1可能通过染色质重构影响炎症基因表达。KEGG通路分析揭示处理特异性调控网络：在基础条件下（oeBLOC1S1-NC对CAG-NC），“补体和凝血级联”显示显著激活（p<0.001），表明BLOC1S1增强先天免疫的潜力，而“细胞粘附分子（CAMs）”富集支持其细胞间通讯作用。16M LPS处理组（CAG-16M LPS对CAG-NC）显示“铁死亡”、“溶酶体”和“细胞因子-细胞因子受体相互作用”通路强烈激活（-log10(P) > 10），与16M LPS诱导炎症损伤和代谢失调一致。BLOC1S1过表达伴随LPS处理（对CAG-16M LPS）后，“PPAR信号”和“嘌呤代谢”通路显著下调（Ratio<0.5），表明BLOC1S1可能通过抑制能量代谢和脂质调控减弱16M LPS促炎效应。显著地，BLOC1S1过表达特异性抑制铁死亡相关蛋白表达，该过程与炎症细胞死亡密切相关，可能代表关键抗炎机制。

这些发现表明BLOC1S1过表达通过转录和代谢重编程减轻mGSCs-I-SB中16M LPS诱导的自噬激活。

BLOC1S1通过限制TDP-43核转位减弱16M LPS诱导的自噬

为研究BLOC1S1介导自噬抑制的机制，进行免疫共沉淀（Co-IP）鉴定BLOC1S1互作蛋白。用FLAG-BLOC1S1或对照质粒转染mGSCs-I-SB，免疫沉淀和质谱分析鉴定FLAG-BLOC1S1相关蛋白。这些包括脂代谢调控因子：载脂蛋白B（ApoB）、载脂蛋白H（ApoH）、pre-mRNA加工因子（hnRNPA1、hnRNPA3、hnRNPAB）和TDP-43——一种多功能RNA结合蛋白，先前涉及调控自噬。具体地，TDP-43调控raptor和Dynactin1转录本剪接，分别通过TFEB和溶酶体-自噬体融合 govern mTORC1介导的溶酶体生物发生。此外，TDP-43稳定ATG7，其敲低损害自噬流。因此聚焦TDP-43进行机制探索。

AlphaFold 3结构建模预测有利的BLOC1S1-TDP-43结合界面。双分子荧光互补（BiFC）测定证实它们的互作：类似阳性对照共转染pBiFC-VN173-BLOC1S1和pBiFC-VC155，共表达pBiFC-VN173-BLOC1S1和pBiFC-VC155-TDP-43证明重构GFP荧光特异性定位细胞质。共转染HEK293T细胞与pBiFC-VN173-BLOC1S1和pBiFC-VC155-TDP-43产生FLAG-或HA标签融合蛋白在预测分子量（30和60 kDa）。Co-IP进一步验证mGSCs-I-SB中内源性BLOC1S1-TDP-43复合物。亚细胞定位研究显示核TDP-43（点状分布）和细胞质BLOC1S1；然而，共转染诱导弥漫细胞质共定位。

蛋白分析显示16M LPS上调CAG细胞中ATG7和TDP-43水平，而oeBLOC1S1细胞显示ATG7水平降低，TDP-43水平不变。免疫荧光和核-质分馏揭示LPS增强对照组核TDP-43积累，这在oeBLOC1S1细胞中被废除。这表明BLOC1S1限制TDP-43核输入，削弱其RNA剪接活性。因此，ATG7mRNA去稳定化减少ATG7蛋白水平，抑制16M LPS触发自噬。

总结而言，TLR介导的LPS识别激活AMPK，促进ULK1依赖性自噬起始。同时，细胞质TDP-43转位至核，稳定ATG7转录本以放大自噬流。BLOC1S1通过螯合TDP-43在细胞质（减少ATG7表达）和直接抑制ULK1抵消两条通路，从而缓解16M LPS诱导自噬。

讨论

本研究结果证明B. melitensis16M衍生LPS在mGSCs-ISB中诱导自噬，而BLOC1S1通过结合TDP-43阻碍其核转位减弱该过程。这种互作抑制TDP-43依赖性mRNA剪接，减少ATG7表达，并最终减弱LPS诱导自噬。

不同于典型革兰阴性细菌LPS，B. melitensis16M核心寡糖具有O-多糖链接分支和带正电荷侧链。后者可能中和核心寡糖负电荷，形成“屏障”阻止MD-2/TLR4受体接合，从而抑制免疫响应。与先前观察一致，16M LPS在山羊精原干细胞中诱导自噬效力大于E. coliLPS。该性质进一步由16M LPS驱动上调DDX5和IL-6证明，表明宿主细胞敏感性增强。

OCR数据证明BLOC1S1过表达增强线粒体氧化磷酸化。这种代谢重编程可能通过能量感应通路贡献自噬抑制：升高ATP/NAD⁺比率抑制AMPK同时激活mTORC1，共同抑制ULK1介导自噬体起始。这些发现与自噬的既定代谢控制一致，其中线粒体增强限制自噬流以在应激期间保存资源。在布鲁氏菌感染中，此类BLOC1S1驱动代谢重编程可能使细菌缺乏自噬生态位同时暴露于ROS。

BLOC1S1参与多样细胞过程，包括线粒体蛋白乙酰化、代谢调控和内体-溶酶体运输。作为乙酰转移酶，它与乙酰辅酶A合成酶协作通过蛋白乙酰化维持线粒体完整性。它还通过RANBP2招募BLOC1S1-ΑTAT1复合体促进微管乙酰化。功能关联溶酶体动力学，BLOC1S1作为BLOC-1相关复合体（BORC）亚基，通过ARL8互作介导溶酶体运输。与先前互作组研究一致，IP-MS分析鉴定ARL8、ApoB和ApoH作为BLOC1S1伙伴，强调其在溶酶体运动和脂代谢中的作用。然而，除这些既定功能外，研究揭示新作用其中BLOC1S1空间限制TDP-43于细胞质，阻碍其核转位。这种螯合破坏TDP-43依赖性ATG7mRNA稳定性，抑制16M LPS触发自噬。该机制独立于经典AMPK或PI3K/AKT-mTOR通路，而是依赖直接BLOC1S1-TDP-43互作。

在布鲁氏菌感染期间，T4SS效应器VceC诱导未折叠蛋白响应（UPR）调控IRE1α依赖性衰减（RIDD）途径，降解Bloc1s1mRNA并破坏BORC组装。通过Bloc1s1G360C突变重建BLOC1S1，保留蛋白功能同时逃避IRE1α介导降解，恢复溶酶体运输并减少rBCV形成。研究通过揭示其螯合TDP-43于细胞质能力扩展BLOC1S1功能库，从而限制核TDP-43活性。TDP-43缺失或细胞质错误定位涉及异常溶酶体生物发生、自噬体-溶酶体融合缺陷，和神经退行性疾病如肌萎缩侧索硬化（ALS）和额颞叶痴呆（FTD）。关键地，TDP-43错误定位是ALS和FTD标志，其中细胞质聚集通过核RNA加工功能丧失驱动神经变性。显著地，TDP-43敲除升高隐性外显子包含，表型可通过TDP-43再引入或反义寡核苷酸处理逆转。发现BLOC1S1保留TDP-43于细胞质——从而模拟ALS/FTD病理状态却赋予对抗细菌持续存在保护——表明TDP-43失调的双重致病角色。鉴于BLOC1S1调控TDP-43核质穿梭能力，它值得作为TDP-43蛋白病潜在治疗靶点研究。RIDD介导降解BLOC1S1 mRNA可促进亨廷顿蛋白降解，从而缓解亨廷顿病进展。因此，恢复TDP-43核功能拯救神经变性中自溶酶体缺损，BLOC1S1调控TDP-43穿梭能力定位它作为细菌感染和TDP-43介导神经病理的潜在治疗节点。

BLOC1S1-TDP-43-ATG7自噬调控轴证明在山羊、小鼠和人类中深远进化保守性。在序列水平，BLOC1S1保持>98%同源性并普遍作为BORC复合体核心亚基，通过ARL8 GTPase介导溶酶体运输。TDP-43显示同等高保守性，特别是在其RNA识别基序（RRMs）和核定位信号（NLS），具有稳定ATG7mRNA作用 across哺乳动物模型——包括小鼠神经元、Hela细胞和山羊精原细胞。它们蛋白序列高保守性提供跨物种保留BLOC1S1-TDP-43互作分子基础，从而确认BLOC1S1-TDP-43-ATG7自噬轴功能保守性。在布鲁氏菌感染巨噬细胞研究中，病原体通过RIDD途径降解BLOC1S1，破坏BORC复合体组装。如研究所示，BLOC1S1耗竭增强TDP-43核转位，从而稳定ATG7表达。尽管ATG7对aBCV生物发生非必需，布鲁氏菌复制关键区室，矛盾地，ATG7敲低增加aBCV形成。因此，BLOC1S1-TDP-43-ATG7轴功能抑制巨噬细胞感染期间aBCV生成，代表限制细菌传播的宿主保护机制。

未来研究将通过冷冻电镜和诱变阐明BLOC1S1-TDP-43互作结构基础以鉴定可成药界面，同时在原代巨噬细胞和iPSC衍生运动神经元验证该轴以评估其细胞上下文保守性。将开发治疗策略设计双功能化合物 either增强BLOC1S1-TDP-43结合以对抗胞内病原体如布鲁氏菌或破坏该互作以恢复ALS/FTD模型中核TDP-43功能。平行临床研究将关联BLOC1S1多态性与布鲁氏菌病和TDP-43蛋白病队列疾病进展，桥接基础机制至精准医学应用跨越感染和神经退行性疾病。

本研究阐明先前未识别机制 whereby BLOC1S1通过TDP-43空间调控限制LPS驱动自噬，补充其细胞器运输和翻译后修饰经典作用。