肿瘤-组织边界作为指导性界面调控乳腺癌细胞侵袭行为

本研究发现肿瘤-组织边界作为指导性界面（instructive interface）而非选择性过滤器（permissive filter），通过三维胶原基质模型证明所有MDA-MB-231细胞均能跨界面迁移并发生表型转化。研究结合单细胞迁移分析、增殖异质性检测和计算模拟，揭示了细胞外基质（ECM）拓扑结构通过力学传导（mechanotransduction）直接指导癌细胞获得侵袭性表型（包括定向迁移增强和增殖加速），为靶向肿瘤微环境（TME）的转移干预策略提供了新视角。

　　

Abstract

转移性癌细胞侵袭远端组织需要跨越多种组织边界，每个边界都带来不同的结构和生化挑战。特别是致密的、富含细胞外基质（ECM）的肿瘤组织与周围基质组织之间的边界，与MDA-MB-231乳腺癌细胞迁移后的表型变化相关，包括侵袭性和攻击性增加。目前尚不清楚这种转变是由于对预先存在的亚群（如癌症干细胞）的选择性过滤，还是整个细胞群体的指导性反应。本研究通过结合单细胞迁移分析、细胞增殖异质性分析和计算建模，证明肿瘤-组织边界充当指导性界面。使用已建立的三维纤维胶原I基质界面模型，显示所有细胞都能跨界面迁移，没有亚群选择性过滤的证据。迁移和非迁移细胞之间的增殖异质性保持不变，进一步支持了指导性机制。模拟结果证实界面指导性地调节细胞行为。这些结果表明组织边界可以重编程癌细胞表型，代表了转移进展中一个潜在的可靶向机制。

1 Introduction

癌症是一种以遗传和表型多样性为特征的多方面疾病。乳腺癌像许多其他恶性疾病一样，通过基因突变和环境影响的复杂相互作用发展，共同决定癌症的进展和转移扩散。转移是指癌细胞从原发肿瘤脱离、侵袭周围组织、进入血液或淋巴系统并在远端器官定植形成继发肿瘤的多步骤过程。这一过程的核心是肿瘤细胞中体细胞畸变的积累。这些遗传改变促进不受控制的增殖，并可以增强肿瘤细胞的转移潜力。一个突出的例子是TP53基因突变，经常导致功能获得，促进不受控制的细胞增殖并增强多种癌症类型的肿瘤攻击性。基因组不稳定性驱动的突变随机积累在肿瘤内产生遗传多样性，导致出现遗传和表型上不同的亚克隆。这种遗传和表型异质性强调了肿瘤的适应性和进展，并对有效治疗构成重大挑战。亚克隆多样性可以通过预先存在的耐药亚克隆的扩张或治疗施加的选择压力驱动的新亚克隆的出现来驱动治疗抵抗。在这种背景下，癌症干细胞在文献中被讨论为高度攻击性的亚群和初始治疗后肿瘤复发的主要来源。了解肿瘤细胞异质性在肿瘤进展和转移级联过程中如何演变是至关重要的，因为它是癌症的一个标志，使诊断和治疗复杂化。此外，增加的肿瘤异质性与患者较差的临床结果相关。

值得注意的是，除了肿瘤细胞本身的遗传和表型多样性之外，肿瘤微环境（TME）在癌症进展过程中经历广泛的分子和结构演变。TME由提供结构支持的细胞外基质（ECM）大分子以及成纤维细胞和免疫细胞等细胞成分组成，这些成分共同贡献于TME的整体功能。这种不断演变的微环境不仅驱动进一步的异质性并促进癌发生，而且在肿瘤细胞侵袭和转移中起关键作用。这种演变的一个关键方面是增加的组织力学和结构异质性。许多天然组织，包括真皮、软骨以及受伤或再生组织，表现出空间上不同的区域，这些区域在ECM组织、密度和刚度上不同。在癌症的背景下，肿瘤和周围组织之间出现区域差异，形成具有ECM密度鲜明对比的离散界面。这些结构异质性界面日益被认为是侵袭性细胞行为的调节者，并可能显著影响转移传播。肿瘤组织的逐渐硬化和致密化是由ECM成分沉积增加、基质纤维交联和重新排列引起的。在ECM成分中，I型胶原在肿瘤硬化中起核心作用，其数量、排列和交联深刻影响TME的生物力学特性。TME内的这些力学和结构变化通过癌细胞和ECM之间的双向通信塑造肿瘤细胞行为。细胞感知并响应其微环境的改变物理特性，通过调节基因表达和重塑周围环境，创建一个驱动恶性肿瘤并促进肿瘤攻击性的反馈循环。例如，研究证明胶原基质特性，如原纤维直径和交联，直接影响乳腺癌细胞的迁移和聚集行为。此外，增加的胶原密度与源自实体瘤的肿瘤细胞的侵袭特性增加相关。这些相互作用不仅促进侵袭表型，而且有助于ECM重塑事件。随着这些过程继续重塑TME，它们在肿瘤边界形成明确界定的ECM界面，肿瘤和健康组织之间对比的生物力学和组成特性变得明显。这些界面作为转移级联过程中的第一个拓扑和力学不连续性，侵袭性肿瘤细胞必须跨越这些界面才能成功侵袭周围组织。

先前的研究已经建立了肿瘤和周围健康组织之间边界的生物模拟ECM模型，以研究乳腺癌细胞在转移早期阶段跨肿瘤-组织界面迁移时的行为。该模型使用具有两个隔室的设计，其中两个不同的三维纤维胶原I基质通过顺序纤维化过程重建，创建两个不同基质的尖锐界面。几项研究显示，嵌入较密基质隔室中的MDA-MB-231乳腺癌细胞跨界面迁移到开放基质中，导致明显且显著的表型转向更侵袭和攻击的行为。界面迁移后，这些细胞表现出从随机迁移到更定向迁移的转变，增殖增加和对阿霉素的化学抗性增强。重要的是，这种表型转换不是侵袭到更开放多孔基质或在其中接种细胞的结果，而是由跨越基质界面本身的尖锐结构不连续性 specifically 触发的。依赖于改变的基质刚度（或所谓的“硬度趋化性”）或氧梯度内的化学趋化性作为触发因素也被排除。此外，转录组分析显示，表型改变的细胞中与转移相关的基因簇特异性上调。增加的DNA损伤和力学传导失调，由迁移过程中的强烈局部收缩力驱动，最近被确定为这些表型变化的潜在机制。值得注意的是，虽然MDA-MB-231细胞通常在较密的胶原I基质中表现出更高的侵袭行为，但报告的从开放到致密基质跨定义界面迁移的表型变化不存在。最近的研究显示，从开放到致密的迁移不会诱导迁移行为、形态、增殖、化学抗性或基因表达特征的变化，也不会触发机械应力响应或力学传导信号。

虽然这些发现强调了基质界面的结构特性以及迁移过程中的机械和生物应力对肿瘤细胞的深远影响，但它们也提出了界面是否指导初始隔室中全部乳腺癌细胞群体的表型变化，或 permissively 过滤具有更侵袭、攻击或遗传不稳定特性的预先存在亚群的问题。例如，这种预先存在且更攻击的亚群被讨论为癌症干细胞。因此，本研究建立在先前的观察基础上，询问乳腺癌细胞在致密到开放基质界面迁移过程中的表型变化是否源于特定预先存在亚群的选择性 permissive 过滤，或初始群体所有细胞的指导性变化。我们使用已建立的MDA-MB-231乳腺癌细胞系和基于三维纤维胶原I隔室的生物模拟肿瘤-组织界面模型进行单细胞迁移分析和两个隔室中的细胞计数，以及迁移前后细胞增殖的异质性分析。将 permissive 和指导性情景中细胞行为的模拟结果与细胞实验进行比较。我们的结果 strongly 支持基质界面作为乳腺癌细胞行为调节者的指导性功能，为ECM拓扑调节肿瘤侵袭性和转移的机制提供了有价值的见解。

2 Results

2.1 Topological Features of Engineered Collagen I Matrix Interfaces and Their Functional Impact on Transmigrating Breast Cancer Cells

ECM的改变，包括其结构、组成和刚度的变化，与癌症的进展和扩散相关，直接影响转移级联。在肿瘤进展过程中，广泛的基质重塑导致致密、硬化的肿瘤组织与更柔软、更多孔的周围健康组织之间形成明显的界面，对侵袭性乳腺癌细胞构成挑战。先前的研究表明，当MDA-MB-231乳腺癌细胞跨明确界定的基于胶原I的基质界面迁移时，特别是当从致密迁移到更多孔基质时，它们经历显著的表型变化，获得更攻击的表型，包括基因表达、侵袭性、增殖和化学敏感性的变化。特别是，发现孔隙率的急剧增加，独立于基质刚度，诱导这种表型转换，强调了界面处结构不连续性的重要性。重要的是，这种效应不是简单的MDA-MB-231乳腺癌细胞侵袭到更多孔胶原I基质的结果，而是跨越尖锐拓扑 distinct 基质界面本身的结果，如引言中讨论的。此外，具有反向配置的基质界面，即细胞从多孔迁移到更致密基质，不会导致任何细胞表型或基因表达的变化。这突出了肿瘤-组织界面在乳腺癌细胞转移早期阶段的独特和重要作用，其中细胞响应基质界面的拓扑特性而表现出表型转换。然而，它提出了基质界面是对整个细胞群体施加指导性影响还是 permissively 过滤预先存在的、更攻击的亚群的问题。

我们现在假设肿瘤和健康组织之间的明显基质界面指导细胞在迁移过程中改变其表型。在这个过程中，每个到达界面的细胞可以跨界面迁移，从而过渡到转移潜力 elevated 的状态，例如显示高度定向迁移和增殖。这一假设得到关于驱动表型变化的分子机制的早期发现的支持。由于相邻基质隔室的不同孔隙率，在界面跨越过程中作用于迁移细胞的不对称力扰乱力学传导信号，包括核完整性，通过改变基因表达进一步影响细胞表型。一个替代假设表明一个 permissive 界面，其中肿瘤-组织边界 permissively 选择细胞，只允许具有预先存在转移潜力的亚群，如癌症干细胞，通过基质界面。具体来说，高度侵袭性乳腺癌细胞系MDA-MB-231已显示表现出显著的遗传和表型异质性，一些亚群以不同比例表达癌症干细胞标志物。除了高自我更新能力外，癌症干细胞表现出增加的增殖、化学抗性和运动性。因此，癌症干细胞可能代表初始较大细胞群体的一个 distinct 亚群，能够跨越基质界面并在界面跨越后显示整体更侵袭和攻击的表型，这与细胞实验中观察到的结果一致。

在这项研究中，我们的目标是证明（或反驳）上述假设，即肿瘤-组织边界作为迁移乳腺癌细胞的指导性界面。为了实现这一点，我们使用了先前建立的三维胶原I基质界面模型。该模型由两个具有不同孔隙率的纤维胶原I基质隔室组成，使用顺序纤维化策略重建。结果，形成明确界定的基质界面，分离致密和多孔胶原I基质，从而模拟肿瘤和健康组织之间的界面。拓扑分析显示，致密基质（'d'）的平均孔隙度约为4 μm，而更开放的多孔基质（'o'）的孔隙度约为5 μm。所有基质的平均原纤维直径保持在约0.95 μm不变。初始细胞群体接种在第二次纤维化步骤中形成的致密隔室中。在下文中，从致密到多孔基质跨定义界面的细胞迁移缩写为'd→o'。未跨越界面并留在致密隔室中的细胞称为'非迁移'（nt），而跨越界面的细胞称为'迁移'（t）。

2.2 Characterization of Breast Cancer Cell Migration at Matrix Interfaces

了解乳腺癌细胞在肿瘤-组织界面如何迁移对于确定这些界面是指导表型变化还是仅仅充当 permissive 屏障至关重要。为了研究这一点，表征了MDA-MB-231细胞在d→o界面的单细胞迁移。通过活体MDA-MB-231细胞在三维基质界面模型中的时间推移成像7天，跟踪并分析了它们在界面附近的迁移在单细胞水平上。迁移指标的量化显示迁移后方向性显著增加，而迁移速度保持在约0.3 μm min^?1不变，与先前的结果一致。这些观察表明，基质界面作为拓扑不连续性，影响细胞运动模式从随机迁移表型到更定向的细胞迁移，而不改变迁移速度。

为了确定所有到达基质界面的细胞是否能够跨越它，或者界面是否选择性阻碍缺乏特定表型特性的某些细胞，我们估计了在24小时的 defined 时间间隔内能够到达基质界面的细胞数量。为了建立这个估计，我们开发了一个基于单细胞跟踪结果的定量工作流程。因此，我们使用了两个基于我们实验观察的假设：1）细胞在第一个（致密）隔室中表现出随机迁移特征。这允许应用单细胞轨迹的均方位移（MSD）分析来评估迁移细胞的平均运动，类似于扩散前沿。2）成功迁移到开放隔室中的细胞采用定向迁移模式，最小化它们跨基质界面返回致密隔室的机会。

基于这些假设，我们首先分析了致密隔室中细胞的MSD以量化它们的随机迁移行为。为了避免有限跟踪持续时间或长期测量中 excessive 噪声的偏差，使用截断分析确定了适当的最大Δt。因此，评估了具有不同最大Δt的个体细胞轨迹MSD的线性回归质量。对于12小时的最大Δt，实现了最佳拟合（最大R²）以及个体细胞轨迹内斜率值的平台。使用这个优化的Δt，进行了单细胞轨迹的最终MSD分析（总成像时间72小时），揭示了MDA-MB-231细胞在致密胶原基质中迁移的平均扩散系数为0.75 ± 0.38 μm² min^?1。该值与先前报道的MDA-MB-231细胞在可比三维环境中的扩散系数一致，加强了我们的方法的可靠性。

为了比较通过随机迁移在24小时内可以到达基质界面的细胞数量以及实际在开放隔室中发现的细胞数量，我们计算了24小时内随机迁移出致密隔室进入开放隔室的细胞数量N_o(24h)。使用从均匀 populated 半空间具有吸收边界的细胞扩散方法，我们揭示了生存函数S(x,t)并在半空间上积分(1 - S(x,t))。吸收边界条件是由我们观察到的迁移后迁移表型改变以及远离界面的定向迁移所 motivated 的。使用这种方法，确定的MSD分析的扩散系数，以及在垂直于界面的156 μm框大小（x方向）内计数的细胞数量，我们揭示：N_o(24h) = (37 μm / 156 μm) N_d(0h) = 0.23 · N_d(0h)，对于可能已经离开致密隔室并将在24小时后在开放隔室中发现的细胞数量。

在界面附近两个隔室的类似体积（xyz: 156 μm × 156 μm × 250 μm）中的细胞在0小时和24小时计数。在时间点0小时预先定位在开放隔室中的细胞可以假设在24小时内离开隔室，因为定向细胞迁移特征和测量的迁移速度，因此不影响细胞计数结果。

由于MDA-MB-231细胞在24小时内表现出2的增殖常数，对于离开致密隔室或迁移后在开放隔室内的细胞，必须大致假设细胞倍增。基于这一事实，我们得出最终预期，即0小时致密隔室中46%的细胞（N_d(0h)）可能在24小时后在开放隔室（N_o(24h)）中被发现， within 我们的主要假设，即界面处没有发生 permissive 选择。由于迁移实验在24小时的短持续时间进行，由于表型改变导致的增殖微小差异不会强烈偏倚细胞计数。

结果显示，时间点24小时开放隔室中的细胞数量线性缩放因子0.48到0小时致密隔室中的细胞数量。这一发现令人印象深刻地同意指导性界面的假设，其中群体的所有细胞都能跨基质界面迁移，正如人们预期初始细胞数量的46%在24小时后在开放隔室中被计数，而我们发现48%。

总之，基质界面的单细胞迁移分析表明，基质界面不作为细胞迁移的物理屏障，既不限制整体细胞运动，也不选择性允许仅具有可能固有更高迁移方向性的细胞迁移。相反，发现支持基质界面诱导细胞内信号传导、改变迁移行为的假设，导致迁移后表型变化以指导性而非 permissive 方式。

2.3 Heterogeneity in Proliferation of MDA-MB-231 Cells before and after Transmigration Across Biomimetic Tissue Interfaces

三阴性细胞系MDA-MB-231以其固有遗传和表型异质性而闻名。这种变异性包括迁移和增殖行为的差异，这些差异与细胞系内的 distinct 亚群相关。先前的研究证明，这些亚群可以使用胶原涂层 transwell assays 或 Matrigel涂层膜基于它们的迁移和侵袭特性进行分选。

鉴于这些亚群的存在，关键是确定肿瘤-组织界面是否可能作为具有更高迁移和/或增殖潜力的 distinct 亚群的 permissive 过滤器，或者如我们假设的那样，作为整个群体的指导性界面。为了支持我们先前关于跨这些界面的无阻碍细胞迁移的发现，我们研究了MDA-MB-231乳腺癌细胞跨基质界面的迁移是否影响群体的异质性，特别比较迁移前后细胞增殖的异质性。我们专注于细胞增殖的异质性，因为MDA-MB-231细胞的增殖已知对亚群异质性敏感地受影响，并且显示受基质界面迁移的影响。增殖异质性的减少将指向对具有特定特性的某些亚群的 permissive 选择。相反，未改变的异质性将支持指导性界面的假设，类似地影响整个群体。

为了量化细胞增殖的异质性，在96孔板格式中建立了一个 assay。使用对数稀释系列创建24个孔的块，每个孔包含前一个块细胞的一部分，直到最终块中的单细胞水平。在细胞培养条件下孵育7天后，使用ATP-发光 assay 量化增殖。通过计算每个接种细胞数量的24个孔结果的变异系数（CV）来评估异质性。对于平均每孔一个细胞的最终块，数据未分析，因为只有一部分孔在7天孵育期后包含细胞。

在细胞培养瓶中标准条件下培养的细胞的对照实验结果显示，随着细胞数量的增加，CV显著降低，表明随着每孔细胞数量的增加，孔间变异性减少。CV对于较大群体的减少表明平均效应减少了亚群分布随机波动的影响。相反，在低细胞数量时，随机效应 play 更显著的作用。具体来说，在小群体中，由于随机抽样，亚群初始比例的变异更可能，导致孔间具有不同增殖常数的细胞比率差异。随着时间的推移，这些差异可以放大，导致增殖变异性更高，并贡献于更高的CV。这些结果证明了 assay 的可行性。

接下来，比较了在均匀致密和多孔胶原I基质中培养的MDA-MB-231细胞的异质性，也作为对照。先前的研究显示，基质特性可以直接影响细胞表型并增加癌症异质性。例如，kPa范围内的基质弹性模量差异与恶性转化和上皮-间质转化相关。在我们的研究中，胶原基质软得多，弹性模量约100 Pa。尽管刚度较低，基质拓扑结构甚至弹性的细微变化仍可能影响细胞行为，从而影响异质性。当检查两种基质密度中的细胞群体时，观察到随着细胞数量的增加，CV类似2D对照减少，表明随着细胞数量的增加，孔间变异性减少。重要的是，两种基质密度之间未检测到CV的显著差异，表明MDA-MB-231细胞系的整体异质性不受基质密度和弹性的影响。

最后，比较了MDA-MB-231细胞在跨d→o基质界面迁移前后的增殖异质性。与基质界面可能作为 permissive 屏障、过滤具有特定增殖特性的亚群的替代假设相反，在两个群体之间未观察到CV的显著差异。此外，CV类似地随着细胞数量的增加而下降，如对照实验中观察到的。这一发现表明迁移过程不改变细胞群体的整体异质性，意味着跨越基质界面的细胞这样做独立于它们的增殖特性。这一结果再次支持肿瘤-组织边界是指导性界面而非 permissive，允许群体的所有细胞平等通过。未改变的细胞异质性与环境约束对迁移细胞施加选择压力的情景形成对比，强调在这种情况下，基质界面不引入群体内的额外异质性或选择偏差。

2.4 Simulation of Influence of Subpopulation Number and Diversity on Cellular Heterogeneity in Proliferation

为了验证细胞异质性 assay 的发现，该 assay 显示在不同细胞培养条件集合（包括细胞培养瓶、不同三维胶原基质和基质界面迁移后）之间细胞异质性没有变化，我们旨在通过使用模拟实验进一步研究不同水平的异质性和亚群数量将如何表现在我们的 assay 中。

模拟包括细胞群体组成的各种情景，从更同质的群体到具有多个 distinct 亚克隆的群体，每个表现出不同的增殖特性。在第一组模拟（'系统'）中，假设（癌症）细胞群体在细胞数量方面具有 equal 分布的亚群。测试了不同数量的亚群，范围从n=2到25。这些亚群的增殖常数R_n对称分布，固定Δ为0.05，围绕平均增殖常数2，反映报道的MDA-MB-231细胞在约24小时内的倍增时间。因此，亚群数量的增加导致增殖常数的更广泛分布。基于以这种方式定义的群体，通过从初始群体随机抽样细胞并随后在每个稀释步骤中从相应孔中抽取来模拟96孔板 assay 中的对数稀释系列。假设指数增长，基于分配的增殖常数计算7天后每个孔中的细胞数量。这种方法使得能够模拟孔中细胞异质性不同水平的增殖变异性，提供亚群数量如何影响 assay 结果的见解。

模拟结果 confirmed 实验数据，随着接种细胞数量的增加，CV显著降低。此外，模拟显示增加亚群数量导致所有接种细胞数量的整体CV增加。这一结果表明群体内更高的异质性导致增殖结果的更显著变异性。在高度异质的群体中，增殖常数的差异导致更高的孔间变异性，即使在更高的细胞数量时，这在实际细胞培养实验中将可能观察到。

为了增加模拟的生物学相关性， refined 生成增殖常数R_n的方法，通过假设围绕平均增殖常数的正态分布。在这个修改的模型（'随机'）中，每个亚群的增殖常数R_n从这个分布中随机抽样，更好地捕捉异质癌细胞群体内增殖速率的自然变异。这种方法解释了在真实生物系统中，亚群之间的增殖差异不一定均匀间隔，而是遵循更连续的分布。再次，发现随着细胞数量的增加，CV减少，类似于模拟的系统模型和实际细胞培养实验。尽管绝对数字较小，但随着亚群数量增加，整体CV增加的趋势也发现与系统模型类似。这种行为是预期的，因为R_n的方差在随机模型中保持恒定（由正态分布确定），而在系统模型中，增加亚群数量导致R_n值的更广泛范围。这解释了随机模型中亚群数量依赖性的 slightly 较弱。此外，在对数稀释系列中引入3%的实验误差以解释潜在的技术不准确性，例如移液错误，也导致效应大小的轻微减少，但不改变关于CV对亚群数量依赖性的整体显著性。

在验证模拟显示CV对细胞数量的依赖性与实验类似并且可以揭示CV对亚群数量的依赖性后，我们研究了基质界面迁移如何影响细胞异质性。我们模拟了两个 distinct 情景，旨在更好地反映我们的实验条件和数据，比较指导性与 permissive 界面的 effects。在指导性和 permissive 模型中，初始非迁移群体被假设具有围绕平均值2的广泛、正态分布的增殖常数。这反映了一个多样化的群体，亚群表现出不同的增殖行为。非迁移和迁移MDA-MB-231细胞群体的增殖常数源自先前的研究，其中报道迁移后增殖显著增加（R(nt) = 2和R(t) = 2.2）。在指导性模型中，假设群体中的所有细胞响应基质界面 upon 迁移 uniformally，导致增殖的协调增加。假设这导致整个群体增殖常数的 uniform 转移，增殖常数的分布从平均值2.0转移到2.2。因此，在这个模型中，所有细胞响应界面经历类似的表型变化，群体的异质性保持恒定。在 permissive 模型中，只有具有固有更高增殖常数（R ≥ 2.15）的亚群被假设在迁移时被界面选择并迁移跨越它。结果，迁移群体代表初始群体的一个子集，富含具有更高增殖常数的细胞。因此，群体更同质， exclusively 由具有更高增殖常数的细胞组成。

为了模拟这些情景，我们从初始分布中随机抽样25个亚群。这些亚群然后用于异质性 assay 的模拟。模拟结果显示，在指导性模型中，所有细胞统一响应界面，整体异质性保持不变，导致非迁移和迁移群体之间CV没有差异。相反， permissive 模型导致迁移后整体CV减少。这种变异性的减少发生是因为基质界面过滤了更快速增殖的亚群，创建了一个更同质的群体。

指导性和 permissive 模型的CV与细胞数量的这种差异将在实际细胞实验中清晰可见。由于我们在细胞培养实验中没有发现这种差异，模拟结果再次支持我们的肿瘤-组织边界作为指导性界面的假设。

总之，模拟实验证明我们的细胞增殖异质性 assay 有效捕捉细胞异质性的变异，包括亚群数量和 spread。虽然实验结果显示非迁移和迁移群体之间CV与细胞数量的趋势没有显著差异，但模拟显示具有不同增殖常数的更高数量的亚群导致增加的CV。这些发现与模拟的预测一致，即在指导性界面的情况下，异质性没有变化，预计CV没有变化。 together，结果 confirm 跨基质界面的迁移不改变细胞异质性，并支持基质界面以指导性而非 permissive 方式作用的假设。

3 Discussion and Conclusion

ECM特性的变化，如TME中胶原密度和刚度的增加，在调节肿瘤细胞行为中起关键作用，特别是在肿瘤和健康组织之间的界面，这些界面作为从原发肿瘤传播细胞的关键部位。先前使用基于纤维胶原I的生物模拟肿瘤-组织界面模型的研究证明，MDA-MB-231乳腺癌细胞跨尖锐基质界面迁移，从致密到多孔基质，在迁移后表现出更侵袭和攻击的表型。这种攻击表型以迁移模式的变化为标志，如增强的方向性，以及 elevated 增殖。值得注意的是，这些研究表明d→o界面在调节肿瘤细胞行为中起重要作用，因为在迁移细胞中直接在基质界面处观察到DNA损伤和力学传导信号的差异。然而，基质界面可能 either 指导表型变化或 permissively 富集具有增加侵袭性和因此迁移和增殖特性的预先存在亚群的精确机制仍然不清楚。重要的是，这种定义的界面不 exclusive 于肿瘤，因为它们是许多健康组织的结构特征，包括皮肤、软骨和再生伤口。因此，理解这些拓扑转变如何影响细胞行为可能提供对超越癌症的更一般生物学原理的见解，具有 implications。

为了解决这个问题，我们调查了两个潜在假设，指导性和 permissive 基质界面。指导性假设提出基质界面通过触发力学传导过程改变所有迁移细胞的细胞表型，导致所有细胞迁移后侵袭性和攻击性增加。相反， permissive 假设表明界面仅仅作为选择性过滤器，只允许那些具有某些预先存在特性（如预先存在的攻击性或发展攻击性的潜力）的细胞跨基质界面迁移。

为了区分这些机制，我们专注于研究肿瘤-组织基质界面对迁移和增殖作为MDA-MB-231乳腺癌细胞系 upon 界面迁移表型转换的标志物的影响。我们首先分析了生物模拟肿瘤-组织界面的单细胞迁移特性，发现没有迁移阻碍或 permissive 过滤MDA-MB-231乳腺癌细胞的证据。在第二组实验中，我们分析了关于增殖的细胞异质性，结合这个 assay 的模拟。模拟显示 permissive 界面将通过选择性富集已经具有更高增殖和迁移能力的亚群导致减少的异质性。然而，在我们的实验中未观察到迁移和非迁移群体之间异质性的显著差异。因此，我们在细胞迁移和增殖异质性上的发现表明整个群体经历协调的、指导的表型变化，而非通过基质界面的 permissive 功能选择性富集攻击性亚群。因此，我们的研究证明了生物模拟肿瘤-组织边界指导性特性的假设。

值得注意的是，乳腺癌细胞系MDA-MB-231固有地以高异质性为特征。先前的研究强调了MDA-MB-231细胞内 distinct 迁移亚群的存在，其中弱迁移细胞表现出更高的转移潜力，部分由于循环肿瘤细胞聚类和E-钙粘蛋白表达。这一事实也反驳了在d→o基质界面 permissive 过滤更攻击亚群的假设，因为我们在基质界面迁移后观察到高度迁移和侵袭的群体。此外，癌症干细胞被讨论构成高度致瘤性和 therapy-resistant 亚群，具有增加的转移潜力。