靶向降解sGRP78重塑免疫抑制肿瘤微环境：乳腺癌新辅助治疗耐药新机制与干预策略

本研究发现可溶性葡萄糖调节蛋白78（sGRP78）是预测乳腺癌新辅助治疗（NAT）疗效的关键血清标志物，揭示其通过诱导IL-10+PD-L1+ B细胞亚群和Treg分化介导化疗耐药的免疫机制。研究创新性构建靶向HER2的纳米蛋白酶复合物（αHER2-subA），特异性降解肿瘤区域sGRP78，有效逆转免疫抑制微环境，为乳腺癌精准治疗提供新型生物标志物和靶向干预策略。

　　

Abstract

乳腺癌新辅助治疗（NAT）耐药机制复杂，本研究通过临床蛋白质组学筛选发现可溶性葡萄糖调节蛋白78（sGRP78）可作为血清标志物预测乳腺癌化疗耐药。建立"sGRP78指数"准确评估患者对NAT的反应性。机制研究表明sGRP78通过结合肿瘤浸润B细胞，诱导其分化为IL-10⁺PD-L1⁺调节性B细胞，进而促进Treg形成并抑制T细胞抗肿瘤毒性。通过构建靶向HER2的纳米蛋白酶复合物（αHER2-subA）实现sGRP78的特异性降解，有效逆转免疫抑制微环境。

1 Introduction

乳腺癌是女性肿瘤相关死亡主因，化疗耐药导致仅39%NAT患者达到病理完全缓解（pCR）。当前基因预测签名对三阴性乳腺癌（TNBC）和HER2阳性乳腺癌预测价值有限。葡萄糖调节蛋白78（GRP78）作为内质网分子伴侣，在肿瘤微环境中通过多种机制促进免疫逃逸。本研究探索sGRP78在乳腺癌NAT反应预测中的作用及其免疫调控机制。

2 Results

2.1 sGRP78 Index as a Serum Biomarker for Patient's Response to Chemotherapy

蛋白质组学分析显示乳腺癌患者血清sGRP78显著升高，尤其在HER2阳性、Luminal B和TNBC亚型。前瞻性研究证实新诊断患者血清sGRP78浓度显著高于健康对照，化疗期间进一步升高超过200 ng·mL^-1。建立"sGRP78指数"（第4轮化疗后血清水平）作为预测指标，指数>200 ng·mL^-1患者无进展生存期显著缩短。典型病例显示sGRP78动态变化与治疗反应高度一致。

2.2 Chemotherapy Induces Breast Cancer Cells to Release sGRP78

体外实验表明化疗药物显著促进E0771(GRP78-mCherry)和B16-F10(GRP78-mCherry)细胞释放sGRP78。体内三种乳腺癌模型（nab-P处理EMT-6、Lb处理4T1、nab-P处理MMTV-PyMT）均显示化疗组血清sGRP78显著升高。机制研究发现化疗后细胞膜GRP78快速减少，证实sGRP78主要通过细胞膜脱落途径释放。

2.3 sGRP78 Release Promotes Cancer Drug Resistance

sGRP78^hi肿瘤模型显示化疗后肿瘤快速生长和肺转移，而sGRP78^lo模型对化疗敏感。E0771(GRP78-mCherry)肿瘤较对照组缩小更慢，外周血和淋巴结中mCherry⁺肿瘤细胞比例显著增高，证实肿瘤来源sGRP78介导化疗耐药。

2.4 sGRP78-Conditioned B Cells Possess Regulatory Function

TNBC患者肿瘤组织分析显示sGRP78^hi组Treg和IL-10⁺ B细胞浸润增加。三种小鼠模型重现该现象，sGRP78^hi肿瘤中调节性淋巴细胞频率显著升高。流式细胞术和免疫荧光证实sGRP78直接结合肿瘤浸润B细胞和髓系细胞。

2.5 Adoptive Transfer of sGRP78-Conditioned B Cells Exacerbates Tumor Immunosuppression

sGRP78条件培养的B细胞（Bgrp78）上调IL-10和PD-L1表达。Bgrp78与T细胞共培养显著增加Treg比例并减弱细胞毒性。体内实验显示Bgrp78注射促进肿瘤进展和肺转移，加剧免疫抑制微环境。

2.6 Nanobody-subA Fusions Enable Targeted sGRP78 Degradation

构建HER2纳米蛋白酶融合物（αHER2-subA），其与HER2⁺癌细胞结合亲和力（K_d=21.5 nM）与单独纳米抗体相当。体外实验证实αHER2-subA有效降解sGRP78，显著降低HER2⁺癌细胞上清sGRP78水平。共培养实验显示αHER2-subA处理逆转B细胞免疫抑制表型，减少Treg诱导。体内实验表明αHER2-subA显著抑制肿瘤生长，延长生存期，降低肿瘤内sGRP78水平和调节性淋巴细胞浸润，且未观察到明显毒性。

3 Discussion

本研究确立sGRP78作为乳腺癌诊断和NAT疗效预测的双功能血清标志物。发现化疗通过细胞膜脱落机制诱导sGRP78释放，其通过调控B细胞功能塑造免疫抑制微环境。创新性开发靶向降解策略，为克服化疗耐药提供新方案。

4 Experimental Section

采用临床队列样本、多种小鼠肿瘤模型和分子生物学技术开展研究。通过蛋白质组学、流式细胞术、免疫印迹、免疫荧光等方法进行机制探索。使用重组蛋白技术和纳米抗体工程构建靶向治疗分子，通过体内外实验验证疗效和安全性。