阿尔茨海默病代谢失调机制研究：基于脑组织代谢组学的高通量分析

本刊推荐：本研究采用前沿高分辨率代谢组学技术（LC-HRMS）对162例人额叶皮质样本进行分析，揭示了阿尔茨海默病（AD）神经病理学与155种代谢特征和36条通路的显著关联。研究首次通过Level-1证据确认了18种新型代谢物（包括葡萄糖和腺苷5′-二磷酸核糖），并发现载脂蛋白E（APOE）ε4等位基因非携带者中葡萄糖代谢和嘌呤代谢扰动更为显著。该研究为AD的分子机制提供了突破性见解，对开发靶向代谢干预策略具有重要价值。

　　

1 研究背景

阿尔茨海默病（AD）作为第六大死亡原因，目前影响美国超过600万人，预计到2060年将增长至1380万人。AD的主要神经病理学特征包括神经元外β-淀粉样蛋白（Aβ）斑块的积累和神经元内过度磷酸化tau蛋白形成的神经原纤维缠结（NFT）。当前治疗策略主要针对疾病进展的关键分子通路，但开发疾病修饰疗法需要更深入地理解AD的生物学机制，包括Aβ斑块产生与聚集、NFT形成以及神经炎症、氧化应激和突触功能障碍等互联过程。

代谢组学作为一种新兴的组学技术，能够表征组织或生物流体中数千种小分子和内源性生物通路的扰动。代谢功能障碍是AD的核心特征，因此理解大脑代谢组与AD的关系可能指向干预新靶点的发现和反映大脑环境相关变化的生物标志物。尽管代谢组学在AD病因学中的应用仍处于起步阶段，但先前基于脑组织的代谢组学研究多采用靶向方法，这些方法通常只能分析几百种代谢物，可能会遗漏与AD病理相关的新颖或低丰度分子特征。

非靶向代谢组学旨在全面、无偏地分析代谢组，为暴露和疾病的分子特征提供更整体的测量。尽管少数非靶向研究已经调查了大脑代谢组与AD病因学，但这些初步应用在识别与AD神经病理学相关的代谢物和通路方面显示出巨大潜力。然而，先前的研究通常使用商业非靶向平台检测不到1000个代谢特征，并且往往侧重于病例-对照比较，对特定神经病理学标志物如Braak阶段或CERAD评分的调查有限。因此，需要进行更大规模的系统研究，以复制和验证初步发现，并识别大脑代谢组中能够提供AD神经病理学新机制见解的额外代谢物和通路。

2 研究方法

本研究人群来自埃默里阿尔茨海默病研究中心（ADRC）的脑库捐赠者。该脑库共有1011名捐赠者，本研究分析了其中162个可用样本，这些样本来自2007年后去世、死亡年龄在55岁及以上且神经病理学结果（Braak阶段、CERAD评分和综合阿尔茨海默病神经病理变化ABC评分）及关键协变量（包括死亡年龄、死亡年份、种族、性别、教育程度和APOE基因型）无缺失值的捐赠者。

AD神经病理学评估采用已建立的全面研究评估和诊断标准进行。所有神经病理学检查包括使用各种组织学染色和免疫组织化学制备评估阿尔茨海默病相关神经病理学变化的严重程度，并由经验丰富的神经病理学家使用公布的标准对多个脑区的多种神经病理学变化进行半定量评分。使用的AD严重程度测量指标包括Braak阶段、CERAD评分和ABC评分。Braak阶段将NFT分为七个严重程度级别（0-VI阶段），较高阶段表明NFT在大脑中的分布更广。CERAD评分描述了新皮质中神经炎斑块的普遍性，分为四个级别，从无神经炎斑块到频繁。ABC评分将前两者与大脑中淀粉样斑块的分布（Thal评分，范围0-5）相结合，产生四个级别的阿尔茨海默病神经病理变化：无、低、中或高。

采用先前建立的方案对前额叶皮质组织进行高分辨率代谢分析。每个样本使用液相色谱-高分辨率质谱（LC-HRMS）技术（Dionex Ultimate 3000，Thermo Scientific Q Exactive HF）进行三重分析。应用两种色谱分析柱：正电喷雾电离（ESI）的亲水相互作用液相色谱（HILIC）和负电喷雾电离的反相（C18）色谱。通常，高极性代谢物通过HILIC柱更好地分离，而较低极性或长链代谢物、磷脂或多酚化合物可以通过C18柱捕获和分离。每个检测到的信号通过精确质量（5 ppm）测量质荷比（m/z）、从色谱柱洗脱的相关保留时间（RT）和积分离子强度进行相对定量。

分析运行后，原始仪器文件使用ProteoWizard转换为.mzML格式，并使用xMSanalyzer修改的apLCMS提取信号，执行峰检测、m/z和RT对齐、特征定量、批次校正和数据质量过滤。为了优化代谢组学数据质量，仅包括在>15%的脑组织中检测到、技术重复间中位变异系数（CV）<30%且Pearson相关系数ρ>0.7的代谢特征。 resulting分析数据包含由m/z、RT和离子强度定义的个体特征。然后，对至少有一个非零强度的重复样本进行平均，并进行log2转换以进行统计分析。

使用非靶向代谢组范围关联研究（MWAS）工作流程评估代谢特征与AD神经病理学标志物的关联。MWAS模型使用序数逻辑回归（OLR）来识别与感兴趣结果显著相关的特征，控制死亡年龄、种族、性别、教育程度、死后间隔（PMI）和APOE基因型。比例优势（PO）假设使用Score检验对每个代谢特征进行检查。仅考虑满足PO假设（p值>0.05）的特征进行最终分析。使用Benjamini-Hochberg（错误发现率FDR）方法进行多重比较校正。

为了预测LC-HRMS输出的代谢特征的功能活性，进行了通路富集和化学注释分析。通路富集使用R包metapone进行，未调整p值0.05作为cutoff。Metapone是一个新颖的生物信息学平台，用于预测非靶向代谢组学数据的功能生物学活性，而不依赖于已识别或验证的代谢物进行通路映射。为了最小化假阳性发现的机会，仅包括由metapone识别的与AD神经病理学标志物相关的生物学通路，调整p值小于0.05且至少四个显著代谢物通过m/z与已知化合物匹配。

为了减少假阳性发现，对于与AD神经病理学标志物显著相关（p值<0.05）并在相关通路中富集的每个显著代谢特征，通过视觉检查提取离子色谱图（EICs）筛选其保留时间、同位素模式和谱峰质量，以区分真实峰与噪声（呈现清晰的高斯峰形和信噪比 above 3:1）。通过m/z（±10 ppm差异）和保留时间（±10秒）与在相同实验条件下分析的真实化合物匹配的特征被分配Level-1置信度。

进行了几个敏感性分析以评估结果的稳健性。首先，用多元线性回归（MLR）替代OLR，将神经病理学标志物视为连续变量。其次，通过控制来自匹配DNA甲基化样本估计的神经元细胞比例额外调整OLR模型。第三，通过控制代谢特征的前三个主成分调整回归模型以控制批次校正期间未调整的额外技术变异。第四，为了评估使用不同q值和p值cutoff进行通路富集分析显著性的影响，使用q值<0.2和原始p值<0.01进行敏感性分析。最后，为了更好理解显著代谢特征与AD神经病理学标志物之间的关联如何受APOE ε4基因型影响，包括显著代谢特征（通过Level-1证据确认）与APOE基因型（存在或缺失ε4等位基因）的乘法交互项以测试效应修饰，并呈现从该交互模型得出的分层效应估计。

3 研究结果

本研究分析的162名捐赠者的平均死亡年龄为76.2岁（SD：9.3岁）。大多数捐赠者为白人（89.5%）、男性（56.2%），并拥有大学学位或更高教育水平（77.7%）。样本中，43.8%有一个APOE ε4等位基因，13.0%有两个拷贝。近一半参与者被分类为最高Braak阶段（46.3%），超过一半处于最高CERAD（69.8%）和ABC（58.6%）类别。基于ABC评分，72.7%的捐赠者有病理确认的AD（分类为中或高ABC评分）。基于临床诊断，大多数参与者被诊断为阿尔茨海默病（52.5%），其次是额颞叶痴呆（13%）和肌萎缩侧索硬化（9.3%）。

经过数据质量保证和质量控制，使用HILIC正ESI和C18负ESI从前额叶皮质样本中分别提取了20,051和15,927个代谢特征。其中，在HILIC正ESI和C18负ESI柱中分别有590和529种代谢物通过Level-1证据确认。

总共155个代谢特征在与死亡年龄、种族、性别、教育程度、PMI和APOE基因型调整及多重检验后与AD神经病理学标志物显著相关（q值<0.05），包括HILIC柱中26、17和20个代谢特征，以及C18柱中64、12和16个代谢特征，分别对应ABC、Braak阶段和CERAD。当使用q值<0.2作为显著性阈值时，这些数字增加到HILIC柱中45、35和23个代谢特征，以及C18柱中765、97和20个代谢特征，分别与ABC、Braak阶段和CERAD关联。通常，经过FDR校正后，在疏水性C18柱中比亲水性HILIC柱发现更多显著代谢特征。

比较三个神经病理学评分之间重叠的显著代谢特征（q值<0.2）显示，大多数代谢特征在HILIC柱（q值<0.2：31%）和C18柱（q值<0.2：86%）中与ABC独家相关。只有一小部分代谢特征在HILIC柱（q值<0.2：2.5%）和C18柱（q值<0.2：0.49%）中与所有三个神经病理学评分相关，表明三种AD神经病理学测量可能存在不同的代谢反应。

原始p值<0.05的代谢特征用于通路富集分析。总共36条代谢通路与至少一种AD神经病理学测量显著相关。富集的通路涉及10个代谢类别：碳水化合物代谢、能量代谢、核苷酸代谢、氨基酸代谢、脂质代谢、外源物代谢、辅因子和维生素代谢、信号通路、消化系统和神经退行性疾病相关代谢。

在36条显著通路中，大多数通路（k=21）与ABC（斑块和缠结的测量）相关，而较少通路与Braak（缠结；k=16）或CERAD（斑块；k=6）扰动相关。核苷酸代谢，包括嘧啶代谢和蝶呤生物合成，与Braak阶段独家相关。大多数氨基酸代谢通路，如天冬氨酸和天冬酰胺代谢、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢、硫酸盐代谢和氨回收，与ABC独家相关。脂肪酸相关通路，包括脂肪酸代谢、新生脂肪酸生物合成、不饱和脂肪酸生物合成以及α-亚麻酸和亚油酸代谢，仅与CERAD相关。

与在相同实验条件下分析的真实化合物相比，我们确认了18种独特代谢物的化学身份，具有Level-1证据，这些代谢物与至少一种神经病理学名义显著相关，且均在C18中检测到。总之，约2%的总显著特征通过Level-1证据确认（HILIC和C18柱中分别检测到80和819个独特显著特征）。ABC与所有确认的代谢物显著相关，CERAD与11种确认的代谢物相关。没有确认的代谢物与Braak阶段相关。通常识别的代谢物涉及氨基酸代谢、脂质代谢、碳水化合物代谢、核苷酸代谢以及辅因子和维生素代谢。

具体而言，对于碳水化合物代谢中富集的所有代谢物，我们观察到这些代谢物强度的增加与较高神经病理学标志物的几率正相关，最大效应在葡萄糖中观察到（ABC：几率比（OR）[95%置信区间（CI）]每代谢特征IQR增加=1.59 [1.14, 2.22]；CERAD：OR [95% CI]=1.74 [1.12, 2.70]）。此外，嘌呤代谢中富集的几种代谢物，包括1-甲基腺苷、肌苷5′-磷酸和鸟苷5′-二磷酸，与神经病理学变化的几率负相关（ABC与所有三种相关，CERAD仅与鸟苷5′-二磷酸相关），几率比彼此相似。

进行了几个敏感性分析以评估结果的稳健性。使用了三种替代建模方法 besides我们的主要OLR模型。我们使用MLR替代OLR，将神经病理学标志物视为连续变量，并额外调整OLR模型以考虑样本间估计细胞类型比例的差异，以及使用代谢特征的前三个PC控制技术变异。总体而言，所有三种OLR模型中显著代谢物的数量相似，即使在包括细胞类型比例或PC作为额外协变量后。MLR模型在调整多重检验后识别出更少的代谢物。

接下来，我们对上述三种替代建模方法进行了通路富集分析。当使用MLR时，与至少一种AD神经病理学标志物显著相关的富集通路更多（n=50）。与主要分析类似，这些通路主要涉及13个代谢类别，其中10个与主要分析相同，另外包括聚糖生物合成和代谢、膜转运（ABC转运蛋白）和次级代谢物生物合成。与主要分析类似，ABC与大多数通路相关（n=41），并与七个氨基酸代谢通路独家相关。几种碳水化合物代谢通路，包括淀粉和蔗糖代谢、糖酵解和糖异生以及半乳糖代谢，被发现是三种神经病理学标志物之间的常见通路。当将细胞类型和PC的额外协变量分别添加到OLR模型时，我们也发现一致的代谢类别和通路，但这些通路中富集的显著代谢物较少，每个代谢类别中的通路种类也较少。在这些通路中，只有氨基酸代谢中的氨回收是新发现的，与主要结果相比。

为了评估在通路富集分析中使用不同q值和p值cutoff进行显著性的影响，我们使用q值<0.2和原始p值<0.01进行了敏感性分析。与主要分析相比，使用这些不同的显著性cutoff时，类似的通路被富集。

最后，我们评估了APOE基因型对显著Level-1代谢物与AD神经病理学标志物之间关联的效应修饰。对于大多数代谢物，无论APOE基因型是否存在，几率比都相似。交互检验仅显示葡萄糖对ABC和CERAD（p<0.01）以及嘌呤代谢中的腺苷5′-二磷酸核糖（CERAD p=0.02）存在显著差异，均表明这些代谢物与AD相关神经病理学标志物之间的关联在无APOE ε4等位基因的参与者中更强。

4 讨论

据我们所知，这是关于脑代谢组学扰动与AD神经病理学关联的最大非靶向高分辨率代谢组学研究之一。我们分析了162名脑捐赠者，其中大多数基于Braak阶段、CERAD和ABC评分表现出晚期AD病理。前额叶皮质样本的代谢组学分析在调整潜在混杂因素和多重检验（FDR 5%）后，识别出155个与AD标志物显著相关的代谢特征。值得注意的是，我们识别了几条 novel代谢通路并确认了与AD神经病理学相关的代谢物，包括那些与能量稳态（碳水化合物、能量和脂质代谢）、核酸损伤和修复（嘌呤代谢）以及神经传递和抗氧化防御（氨基酸和神经活性信号代谢）相关的代谢物。

我们分析的一个关键发现是识别了与AD神经病理学显著相关的广泛代谢通路，揭示了驱动AD进展的复杂分子机制。这些通路跨越十个不同的代谢类别，包括碳水化合物、能量、核苷酸、氨基酸、脂质、外源物、辅因子和维生素、信号以及消化和神经退行性疾病相关通路的关键代谢过程。类似通路已在其他使用死后前额叶皮质、脑脊液（CSF）和AD患者血浆样本的代谢组学研究中报道。

特别感兴趣的是，帕金森病通路与ABC评分显著相关，表明AD和帕金森病潜在致病通路可能存在共同点。与先前AD和帕金森病基因组关联研究的结果一致，我们的结果强调了神经退行性疾病之间复杂的相互作用，并突出了研究共享分子通路在理解其病因和进展中的重要性。此外，神经活性配体-受体相互作用通路与Braak阶段和CERAD均显著相关，表明神经递质信号失调在AD神经病理学中的潜在作用。神经递质系统功能障碍长期以来一直牵涉在AD发病机制中，我们的发现提供了进一步证据支持神经活性配体-受体相互作用在疾病进展中的参与。

值得注意的是，我们的分析揭示了代谢特征和通路与每种神经病理学测量的差异关联。ABC评分与最多数量的通路显著相关，表明其广泛代表AD病理，包括淀粉样斑块分布、神经炎斑块和NFT。Braak阶段反映了NFT的频率和分布，显示与主要涉及核苷酸代谢的通路相关，表明这些通路在tau病理中的潜在参与。脂肪酸相关通路与CERAD独家相关，CERAD描述了新皮质神经炎斑块的频率。

代谢特征注释和验证进一步增强了通路分析的一致性。特别是，18种代谢物通过Level-1证据确认为AD神经病理学相关的特定分子特征提供了宝贵见解。这些代谢物专门在C18疏水柱中检测到，跨越多种代谢通路，包括氨基酸代谢、脂质代谢、碳水化合物代谢、核苷酸代谢以及辅因子和维生素代谢的关键代谢物。先前研究类似地报道了AD表型与几种化学类别代谢物之间的关联，包括酰基肉碱、氨基酸、生物胺和甘油磷脂。

在识别的代谢物中，碳水化合物代谢中富集的代谢物与神经病理学变化的几率正相关，表明葡萄糖失调在AD发病机制中的潜在作用。具体而言，升高的葡萄糖水平与更大的神经病理学相关，与先前研究一致。当脑糖酵解受损时，脂肪酸氧化可能通过在线粒体TCA循环中产生乙酰-CoA来补偿以维持能量稳态。代谢组学研究也显示血浆和CSF样本中改变的能量稳态，包括TCA循环、脂质代谢和线粒体酮体。因此，我们研究中升高的碳水化合物代谢物可能反映葡萄糖利用减少和向替代能源（包括脂肪酸）的转变。有趣的是，这种关联在APOE ε4等位基因非携带者中特别强。

我们还发现嘌呤代谢中富集的代谢物——涉及DNA损伤修复的通路，包括1-甲基腺苷、肌苷5′-磷酸和鸟苷5′-二磷酸，与神经病理学负相关。这表明嘌呤代谢可能有助于减轻AD病理， possibly通过神经保护和突触功能调节。再次，这种模式在APOE ε4等位基因非携带者中更强。

我们研究的优势在于我们采用的综合方法，整合了各种方法学和分析技术以阐明与AD神经病理学相关的代谢扰动。首先，我们利用了一个非靶向高分辨率代谢组学平台 coupled with全面代谢组学分析。具体而言，我们当前的平台在HILIC和C18柱中检测了超过36,000个代谢特征，提供了比其他非靶向平台更大的分析深度，这些平台通常报告少于1000个特征并依赖于预定义的化合物库和更窄的色谱窗口。这些36,000个代谢特征的生物学解释通过两种互补方法 facilitated：（1）我们使用了一个新颖的生物信息学平台来预测代谢物的功能生物学活性，而不依赖于已识别或验证的代谢物进行通路映射；（2）我们通过真实标准确认了约600种代谢物，实现了高置信度（Level-1）识别。这种 method学组合使我们能够识别和表征与AD神经病理学标志物相关的代谢特征和通路，为AD发病机制的分子机制提供见解。此外，我们的研究通过直接调查脑组织样本中的代谢改变超越了传统分析，这是相对于仅依赖外周生物标志物的研究的重大进步。第三，我们的研究方案包括三种类型的稳健AD神经病理学表型测量，最小化了错误分类偏倚的可能性。

尽管我们的发现具有生物学合理性和统计稳健性，但应承认AD神经病理学代谢组学研究的几个常见局限性。首先，横断面设计无法确定代谢特征与AD标志物之间观察到的关联的因果关系和方向性。虽然纵向研究在死后脑组织不可行，但描述死前代谢变化（例如在CSF中）可能提供AD相关变化的时间动态见解。未来的工作还应探索脑代谢组学特征与死前认知评估的关系。第二，脑代谢本质上是动态的，可能受死后因素或未测量的生物或环境变量影响。虽然我们采用了严格的质量控制和统计调整，但残留或未测量的混杂不能排除。因素如合并症、肥胖、营养、药物使用和生活方式因素可能影响代谢谱和AD神经病理学。第三，代谢物注释基于现有的血清代谢物数据库，这可能无法全面捕捉前额叶皮质组织的独特代谢景观。分析标准库的局限性也限制了识别准确性。更全面的代谢组学数据库和通路注释对于获得更深入的分子见解至关重要。此外，我们的分析仅侧重于前额叶皮质样本。虽然该区域与AD相关，但其他脑区（例如海马）可能提供对全脑代谢组学变化更全面的理解。虽然我们的样本量足以检测显著关联，但需要在独立脑库中复制。我们的队列主要是受过良好教育的白人，可能限制普遍性。需要更大、更多样化人群的未来研究。最后，埃默里ADRC脑库是一个便利样本，富含AD和相关疾病，不是基于人群的队列，这可能影响代表性。

5 结论

在这项关于AD神经病理学标志物的全面脑代谢组学调查中，我们识别了 numerous代谢特征和通路与AD神经病理学显著相关。我们还确认了几种Level-1代谢物涉及氨基酸、脂质、碳水化合物、核苷酸以及辅因子和维生素代谢。值得注意的是，一些确认的代谢物在APOE ε4非携带者中显示出更强的关联，他们在神经病理学标志物中具有比APOE ε4携带者更大的变异性。这些发现增强了我们对AD相关代谢改变的理解，并突出了代谢组学分析揭示疾病机制的潜力。需要进一步研究来验证和探索这些代谢物在AD进展中的功能作用。