阿尔茨海默病神经病理学中显微技术与磁共振成像的三维融合重建：连接微观病理与宏观影像的桥梁

本综述系统整合了冷冻切片、组织学、免疫细胞化学与7 Tesla定量磁共振成像（qMRI）技术，首次在阿尔茨海默病（AD）中脑实现了200 μm分辨率的全脑三维重建。研究通过淀粉样蛋白-β（Aβ）和磷酸化tau（p-tau）免疫标记、细胞体与神经纤维可视化，揭示了左右半球病理负荷的显著不对称性，为神经影像（MRI）与神经病理学（microscopy）的关联研究提供了开创性数据资源，对AD生物标志物验证与疾病机制解析具有重要意义。

　　

Abstract

本研究旨在弥合死后神经病理学评估与磁共振成像（MRI）之间的鸿沟，通过构建并共享一例具有中度阿尔茨海默病（AD）神经病理改变的全人脑三维（3D）模型。研究采用多模态成像技术，包括冷冻切片、组织学、免疫细胞化学和亚毫米分辨率的定量超高场7 Tesla（7T）磁共振成像（MRI）。研究实现了淀粉样蛋白-β（Aβ）和磷酸化tau（p-tau）免疫反应性、细胞体及神经纤维的可视化，并结合定量MRI参数。所有数据以200 μm分辨率进行协同配准并公开共享。全脑切片的使用允许对神经病理学改变进行详细评估，揭示了在单个AD神经病理改变大脑中左右半球在Aβ和p-tau病理负荷方面的明显差异。这一资源为神经影像学与神经病理学显微镜观察之间的详细关联研究以及MRI验证提供了新的途径。

1 INTRODUCTION

阿尔茨海默病（AD）是全球影响人群最多的神经退行性疾病。非侵入性成像技术可在生前揭示神经病理学改变，但明确的神经病理学诊断只能通过死后评估细胞外Aβ沉积形成的斑块和细胞内过度磷酸化tau形成的神经原纤维缠结（NFT）来实现。在许多神经病理学评估中，死后的组织学观察证实了生前的临床诊断，但不匹配的情况也时有发生，认知功能完整的老年人常显示出与AD晚期阶段相符的神经病理学改变。成像技术正在开发中以提供可靠的非侵入性生物标志物，但MRI在多大程度上再现显微镜下观察到的病理分布仍需进一步研究。有趣的是，体内成像方法能够提供全脑神经病理学分布的可视化，而常规的死后神经病理学调查则无法做到这一点。死后的显微镜评估通常依赖于有限数量的组织块进行AD神经病理分期，这种有限的采样过程存在遗漏关键信息的风险。然而，使用显微镜技术对Aβ和p-tau蛋白积累的分布进行全脑3D重建的研究尚未见报道。随着全脑和组织块处理与分析流程的发展，创建个体人脑捐赠者组织学分布的全3D重建所需的方法已经可用。处理流程允许系统地进行MRI扫描、切片和（免疫）组织化学染色，随后在同一空间中对大组织样本进行数字重建。我们小组先前已经发表了两例非痴呆对照的 combined MRI 和显微镜图谱，迄今为止，基于全组织学覆盖的四例非痴呆全人脑已被报道。由此产生的统一图谱允许对定量（q）MRI参数进行生物物理建模，并将MRI与底层解剖特征联系起来。为了实现AD相关神经病理改变成像的类似目标，qMRI可以与p-tau和Aβ病理的免疫标记、Bielschowsky染色和Nissl染色相结合。因此，我们着手通过处理具有AD相关神经病理学改变的捐赠者组织来扩展我们先前的工作。通过仔细选择染色程序中使用的抗体和调整应用的MRI协议，例如通过关注铁积累，从而允许详细绘制AD相关的神经病理改变，我们提供了一个受神经病理学改变影响的大脑的完整重建。该大脑来自一名登记为非痴呆对照的捐赠者，但在我们组织学处理的常规评估中呈现出显著的神经病理学改变。由此产生的描述性数据集允许将结构MRI参数与包括p-tau和Aβ在内的AD蛋白沉积联系起来。除了提供概念验证外，该数据集将具有重大的科学意义，尽管单个大脑无法提供对个体间差异的洞察，而鉴于AD疾病进展和临床表现的强烈个体间变异性，这一点非常重要。

2 METHODS

2.1 Case description

一名捐赠者头部（04-2017，女性，91岁，乳腺癌，肺部感染）来自马斯特里特大学的全身体捐赠计划，经过全身灌注。书面同意在全身体捐赠6年前获得。临床数据非常有限，未显示任何合并症。该捐赠者登记为非痴呆对照，未居住在辅助生活设施中。

2.2 7 Tesla quantitative MRI and tissue processing

定量MRI图谱的弛豫率（R1, R2）和质子密度以400 μm各向同性分辨率在7T下获取，如先前所述。MRI数据使用MAGNETOM 7T全身系统（Siemens Healthineers, Erlangen, Germany）和圆极化射频（RF）发射/32通道接收头阵列线圈（NOVA Medical Inc., Wilmington, MA）获取。协议包括三个3D多回波GRE扫描，具有T1、质子密度（PD）和磁化转移（MT）权重，RF脉冲翻转角（FA）=（38, 7, 7）度，回波数=（8, 8, 6），回波时间（TE）在3.4至21.6 ms之间等间距。MT权重通过每次TR应用一个4 ms长的高斯RF脉冲（3 kHz off-resonance，峰值振幅2.0 μT，BW=450 Hz）实现。序列同时进行了RF和梯度spoiling。矩阵大小为480×640×416（相位×读取×分区），每个对比度的采集时间为1小时46分钟。协议重复扫描四次以获得足够的信噪比（总采集时间7:04小时）。除了加权图像外，还获取了RF磁场图谱用于B1+校正。随后，使用hMRI工具箱（http://www.fil.ion.ucl.ac.uk/spm）在SPM 12框架（http://hmri.info）和MATLAB中计算纵向弛豫率（R1）、质子密度（PD）、磁化转移（MT）和有效横向弛豫时间（R2）的定量图谱。R2*图谱通过普通最小二乘拟合多对比数据计算。

脑 autopsy 后，组织用蔗糖保护并在 Tissue-Tek 中的干冰上冷冻。在200 μm连续冠状切割过程中，所有切片均获取了全脑 blockface 图像，如先前所述。选择切片的苏木精和伊红（H&E）染色由两名 board-certified 神经病理学家进行病理评估。通过评估以下脑区初步识别神经病理学改变：额叶、岛叶、颞叶和枕叶皮层、海马、扣带回、苍白球、尾状核、壳核、黑质、红核、蓝斑、脑桥基底、齿状核、橄榄核和小脑皮层。视觉评估显示存在Aβ斑块以及脑室系统扩张和微出血。随后相应地调整组织处理策略，以系统绘制与AD相关神经病理学相关的神经病理学改变。以1:3（600 μm）染色间隔采样组织切片进行 Bielschowsky 银染色，以提供与髓鞘敏感的R1图谱的对应性用于 coregistration 目的。Aβ斑块在自由浮动切片中染色。简而言之，切片在甲酸（100%，室温20分钟）中透化；在 Tris 缓冲盐水（TBS）中冲洗并使用3% H₂O₂在RT下灭活内源性过氧化物酶30分钟后，切片在 mouse-anti-human amyloid-β（BioLegend cat no. 800701 [previously Covance cat no. SIG-39220], clone 4G8, lot no. B286227）中以1:20,000在4°C下孵育过夜（约0.1 mL抗体溶液/cm²切片表面积）。冲洗后，切片在 biotinylated anti-mouse（1:800, RT 1小时）中孵育。切片在TBS中冲洗并在 avidin biotinylated complex（1:800, RT 1小时）中孵育，随后在TBS中冲洗并使用二氨基联苯胺（DAB）在RT下显色25分钟。切片在 supermix（SUMI, 0.05 M Tris, 0.15 M NaCl, 0.5% TritonX-100, and 0.25% gelatin）中冲洗以防止组织结块，转移到TBS-0.1% Triton X-100中，并 mounted 到明胶包被的载玻片上。干燥后，切片通过一系列递减梯度乙醇重新水化，并用硫堇复染。随后，切片在乙醇中脱水，在二甲苯中透明，最后在 Entellan 中嵌入。

对于神经原纤维缠结的染色，我们在TBS中冲洗切片，灭活内源性过氧化物酶，并在 mouse-anti-human PHF-Tau（Thermo Scientific cat no. MN1020, lot no. WH3346162, clone AT8）中以1:2000在SUMI中在4°C下孵育过夜（约0.1 mL Ab溶液/cm²切片表面积，恒定 agitation）。在TBS和SUMI中洗涤后，切片在 biotinylated anti-mouse（1:800, RT 1小时）中孵育。切片在TBS和SUMI中冲洗并在 avidin biotinylated complex（1:800, RT 1小时）中孵育，随后在TBS中冲洗并使用二氨基联苯胺（DAB）在RT下显色30分钟。切片在SUMI中洗涤两次并转移到TBS-0.1% Triton X-100中以将切片 mounted 到明胶包被的载玻片上。干燥和重新水化后，切片用硫堇染色，脱水，在二甲苯中透明，并使用 Entellan coverslipped。鉴于Aβ和p-tau均用硫堇复染，硫堇的染色间隔为2至3。

3 DIGITIZATION AND RECONSTRUCTIONS

所有切片使用平板扫描仪以1200 dpi成像，图像用于在 blockface 空间中进行大脑的3D重建，如先前所述使用每个切片到相应 blockface 图像的非线性2D配准，以补偿组织处理引起的组织 distortion。配准技术使用基于ANTs中非线性SyN算法的多尺度、多步骤配准方法，包括灰白质过渡的 mutual information 优化。方法和 resulting registration quality 已先前描述。使用与我们先前工作相同的对齐分析进行质量检查，计算处理相同染色协议的相邻切片边界之间的平均距离。随后，选择包括通常用于评估神经病理学改变的皮层和皮层下脑区的个体切片，以提供左右半球AD相关神经病理学的概览。随后在这些切片上使用 QuPath 确定神经病理学负荷。在 QuPath 中，勾勒出感兴趣区域，对图像进行阈值处理（阈值设置为20,000任意单位，因为此设置一致地掩盖了Aβ和p-tau的免疫反应性），并确定感兴趣区域内被免疫反应性覆盖的表面积百分比。

4 RESULTS

在组织学处理之前，捐赠者头部进行了广泛的定量7T MRI扫描（R1图谱、R2*图谱、定量磁化率映射和质子密度映射）。H&E染色在显微镜下评估，揭示了中等程度的AD神经病理改变。这一观察促使我们对选定区域进行更详细的Aβ免疫反应性评估，证实了 phase 3/5，Braak NFT stage 4/6， together with the presence of neuritic plaques。这导致了根据 Montine 等人的 AD神经病理改变：A2, B2, C2。观察到的Aβ斑块更 diffuse than classic-cored。Thorn-shaped age-related tauopathy of the astroglia（ARTAG）存在于杏仁核水平的 mesiotemporally 以及 subpial 区域。在杏仁核中观察到少量 fuzzy astrocytes。神经病理学评估进一步揭示了 cerebral amyloid angiopathy（CAA） stage 1 和 agrophylic grain disease（AGD） stage 4/4。在左枕叶 parastriate 区域存在 old infarction，在黑质中可见少量未进一步定义的 inclusions。随后对数字化染色覆盖的免疫反应性面积百分比进行了测量。该数据与qMRI强度值一起总结在表1中。

所有显微镜切片随后在 common space 中以200 μm分辨率与7T定量多参数MRI重建。为了允许更广泛的免疫反应性与qMRI数据之间的比较，我们共享了 blockface 空间中所有成像模态的配准。3D神经病理学改变在200 μm各向同性分辨率下的重建揭示了新皮层中Aβ病理的广泛分布。Aβ显示出明显不同的分布模式， differentially affecting particular cortical areas（图1）。在 entorhinal cortex 和海马中观察到最强烈的p-tau病理染色。引人注目的是，右胼胝体下扣带回显示出清晰的p-tau积累，这在 contralateral hemisphere 中未观察到（图1B）。染色结果的图示呈现在图1和图2中。qMRI与组织学染色之间的对应关系显示在图3中。此外，连续切片边界之间的平均距离对于 Bielschowsky、SMA 和 CD31 染色分别为0.85、0.97和1.04 mm。值得注意的是：较大的距离局限于最额叶和枕叶脑切片（图4A）。计算了MRI与组织学测量之间的线性相关系数（图4B）。使用不同免疫反应性谱的 color RGB 标记对个体染色模式的分布进行了完整说明，见视频1。MRI对比与Aβ和p-tau病理的对齐进一步在视频2A–D中说明，并且 co-alignments 的质量可以在图5中欣赏，该图显示了重建的矢状面和轴向面。3D重建通过结合定量MRI与组织学结果创建，这允许直接比较组织学谱和MRI。视频可通过数据共享（DOI: https://doi.org/10.21942/uva.c.7260322.v2）访问。

5 DISCUSSION

在此，我们 presented a full reconstruction at a 200 μm isotropic resolution of a human brain with intermediate AD-related neuropathologic change resulting in an A2, B2, and C2 score。我们报告了表1中的密度测量值，应谨慎解释，因为它们仅代表基于单个案例的结果。这些结果提供了概念验证，即通过调整从非痴呆对照标本建立的协议，可以实现疾病特异性蛋白的全脑 mapping。

我们想指出，为了实现 full reconstructions，显微镜切片以21 μm的面内分辨率数字化。这些数据随后下采样至200 μm。神经病理学评估在最高分辨率下进行，直接使用光学显微镜在切片上进行，从而允许比基于图1中的重建更准确地评估神经病理学负荷。Bielshowsky染色和染色程序的包含允许跨模态和半球进行定量比较。我们在相对较少的脑区进行了H&E染色。然而，众所周知，AD相关神经病理学在疾病晚期阶段影响整个大脑。观察到的p-tau更 focal distribution 和更广泛的Aβ免疫反应性分布均与该领域的 seminal literature 一致，神经病理学分期基于此。结合详细定量MRI对比的AD相关神经病理改变的全脑3D重建的创建，现在允许以前所未有的细节水平研究整个大脑的神经病理学改变及其与MRI观察的关系。

本研究中描述的捐赠者在死亡6年前登记为非痴呆对照，除年龄外，重要的是可用的（临床）信息非常有限。未知捐赠者在初始登记为脑捐赠者后是否进展到AD的临床阶段，或者捐赠者是否仍然具有 largely intact cognitive function 并对认知衰退具有 resilience。后者与捐赠者未居住在护理机构的事实相符。鉴于捐赠者的高龄（91岁）以及文献表明认知功能与AD相关神经病理改变不显示一一对应，任何关于捐赠者生命终结阶段认知功能的假设都是推测性的。尽管临床信息有限，创建的数据集显示了一些有趣的结果，除了作为科学资源外。特别是，跨半球的显著不对称性的存在具有潜在相关性（见图1），鉴于通常仅使用一个半球进行神经病理学评估。问题在于不对称病理在多大程度上 contributes to potential differences in clinical phenotypes。早期研究已经证明了AD中不对称皮层神经病理学的存在，这似乎与语言优势半球相关。我们的全脑重建现在允许我们调查更深层大脑结构中的不对称性。与我们先前共享的数据集以及他人报告的数据集一起，越来越多的个体重建大脑的累积发布正在构建一个数字大脑集合，该集合将继续在各种神经退行性疾病中增长，并最终允许 statistical comparisons。

我们选择设计组织学染色程序以可视化AD相关神经病理改变，包括 pretangles 以及 cell bodies 中的 tangles 和 neuronal processes 中的 neuropil threads，以及 neuritic plaques 的 dystrophic nerve cell processes 中的 material。尽管Aβ蛋白分布更广泛，但它显示出显著的异质性，在左 entorhinal cortex 中表达最高（见表1）。重要的是要注意，qMRI信号反映了累积的神经病理蛋白和正常脑组织的复杂信号，因此不直接对应于组织病理学。仅右胼胝体下扣带回的不对称标记与p-tau与先前的正电子发射断层扫描（PET）研究一致，这些研究报告在显示AD认知障碍的人群中右胼胝体下扣带回中tau沉积增加。在临床前AD中观察到的 tauopathy 在 medial temporal 和 adjacent cortices 中的 focal distribution 也与这项工作一致。

AD的金标准神经病理学评估与临床评估（如那些在有价值的体内数据库中报告的，包括阿尔茨海默病神经成像倡议（ADNI））之间的转换有潜力 contribute to a deeper understanding of in vivo neuropathological alterations as imaged using noninvasive approaches such as MRI。Ushizima等人发表了 coregistering MRI 和显微镜观察在AD中的重要工作。这种链接特别有趣，鉴于将AD相关的临床改变与组织学标本中观察到的神经病理学改变进行一对一空间映射的重要性。结合死后定量MRI与组织学处理和全3D重建允许创建和共享科学资源，用于研究人脑解剖学、创建无法使用MRI readily visualized 的小深部脑结构的详细脑图谱以及MRI验证，例如通过映射图像畸变。随着这一重建的发布，作为一个资源，包括定量MRI和免疫反应性，来自具有AD相关神经病理学改变的捐赠者的整个大脑，我们正在开始构建一个重要的全脑集合，我们无限制地向全球研究人员提供，以连接微观解剖学、神经成像和系统神经科学，无论是在正常还是神经退行性大脑中。