天然多酚-金属超分子纳米复合物（bm–Cur–NC）激活铁死亡克服肝癌化疗耐药性

《Aggregate》：Natural Polyphenol–Metal Supramolecular Nanocomplex for Ferroptosis Activation in Chemoresistant Hepatocellular Carcinoma

本刊推荐：本研究创新性地构建了一种基于天然产物双去甲氧基姜黄素（bm–Cur）与铜离子（Cu(II)）自组装形成的超分子纳米复合物（bm–Cur–NC），通过“一石三鸟”策略（抑制谷胱甘肽（GSH）合成、铜离子介导的芬顿反应氧化消耗、迈克尔加成反应直接消耗）协同耗竭肝癌耐药细胞中异常升高的GSH，打破胞质与线粒体氧化还原稳态，同时诱导胞质和线粒体铁死亡（ferroptosis），显著逆转顺铂耐药性。该纳米体系在体内表现出高效低毒的抑瘤效果，为克服肿瘤耐药提供了全新策略。

　　

引言：克服耐药性是癌症治疗的核心挑战。肝细胞癌（HCC）中高水平的谷胱甘肽（GSH）会抑制铁死亡并限制治疗效果。铁死亡作为一种新兴的细胞死亡方式，在克服耐药方面展现出巨大潜力，但其效果受限于肿瘤微环境中高GSH水平。因此，开发能有效耗竭GSH的策略是增强铁死亡、逆转耐药的关键。

bm–Cur–NC的设计、制备与表征

研究团队设计并合成了一种新型超分子纳米复合物bm–Cur–NC，它由天然姜黄素衍生物双去甲氧基姜黄素（bm–Cur）与Cu(II)通过配位自组装而成。bm–Cur是通过去除姜黄素的两个甲氧基得到，其结构中的两个邻苯二酚单元和一个共轭β-二酮部分使其具有优异的金属螯合能力、抗氧化活性和生物安全性。

通过高分辨质谱（HR-MS）、¹H NMR、紫外-可见光谱（UV-vis）、扫描电子显微镜（SEM）、原子力显微镜（AFM）、X射线光电子能谱（XPS）和高分辨透射电子显微镜（HR-TEM）等多种技术手段证实了bm–Cur–NC的成功制备及其结构特征。SEM和AFM显示其呈三角形层状形态，厚度约为7.5 nm。HR-TEM揭示了其均匀的晶格结构，晶格间距约为0.288 nm。元素映射和XPS分析证实了C、O、Cu元素在纳米复合物中的均匀分布以及Cu(II)的成功配位。X射线衍射（XRD）图谱与HR-TEM观察结果一致。红外光谱（IR）分析显示，与bm–Cur相比，bm–Cur–NC的特征吸收峰发生蓝移，证实了螯合物的形成。该纳米复合物在各种生理缓冲液和细胞培养基中均表现出良好的溶解性和稳定性。

体外GSH消耗能力

bm–Cur–NC被设计为具有级联的GSH消耗能力。其作用机制涉及：1） 纳米复合物中的Cu(II)与GSH发生芬顿反应，将Cu(II)还原为Cu(I)，消耗GSH并释放出游离的bm–Cur；2） 释放出的bm–Cur通过其α,β-不饱和酮结构与GSH发生迈克尔加成反应，进一步消耗GSH。

TEM成像直观地显示，bm–Cur–NC在GSH作用下从规整的片层结构解离成分散的碎片。UV-vis光谱分析证实了GSH触发bm–Cur的释放以及bm–Cur与GSH的反应。加入新铜试剂（neocuproine）检测到Cu(I)的生成，进一步验证了GSH触发的解组装过程。HR-MS和ESI扫描数据直接检测到了bm–Cur与GSH的加合物（分子量645.16），证实了迈克尔加成反应的发生。

在细胞水平上，研究发现顺铂耐药HepG2/DDP细胞中的GSH水平（约11.24 μM）显著高于正常肝细胞HL-7702（约3.70 μM）和顺铂敏感HepG2细胞（约6.68 μM）。bm–Cur–NC处理能浓度依赖性地显著降低HepG2/DDP和HepG2细胞中的GSH水平，尤其在20 μg mL^?1浓度下，能将耐药细胞的GSH降至接近正常水平，而对其正常细胞影响很小。相比之下，bm–Cur的GSH消耗能力较弱，而顺铂（DDP）几乎无此能力。

同时，bm–Cur–NC处理能显著降低细胞内H₂O₂水平，但大幅提升羟基自由基（•OH）水平和总活性氧（ROS）水平。共聚焦显微镜（CLSM）成像使用DCFH-DA和HPF探针均证实，bm–Cur–NC是强效的ROS和•OH诱导剂。这些结果表明，bm–Cur–NC能通过双重途径直接耗竭细胞内GSH，升高ROS水平，从而杀伤耐药肿瘤细胞。

诱导胞质铁死亡

由于bm–Cur–NC具有卓越的GSH耗竭能力，研究团队推测其能有效诱导铁死亡。对bm–Cur–NC处理的HepG2/DDP细胞进行转录组学（RNA-Seq）分析发现，2370个基因表达发生显著变化。GO功能富集分析显示，差异表达基因（DEGs）显著富集于“脂质代谢过程”（与铁死亡相关）、“细胞膜区域”、“线粒体基质”等条目。KEGG通路分析表明，上调的DEGs与铁死亡、谷胱甘肽代谢、细胞周期、肝癌、铂类耐药等通路密切相关。从FerrDb V2数据库筛选出的铁死亡相关基因集中，有62个基因与本研究DEGs重叠。蛋白互作（PPI）网络分析揭示了GSH代谢（GCLM, GCLC）、铁死亡（GPX4, SLC7A11, ACSL4）、铂耐药（ABCB1, GSTA1）和肝癌（STEAP3, CP）相关蛋白之间存在紧密相互作用。基因集富集分析（GSEA）进一步证实了铁死亡和谷胱甘肽代谢通路的激活。

为验证测序结果，研究检测了铁死亡的关键特征。使用C11-BODIPY^581/591探针检测脂质过氧化（LPO）发现，bm–Cur–NC处理组在HepG2/DDP和HepG2细胞中均显示出最强的绿色荧光（氧化态），表明LPO水平显著升高，其效果强于铁死亡诱导剂erastin，并可被铁死亡抑制剂Fer-1所抑制。生物透射电镜（bio-TEM）观察显示，bm–Cur–NC处理的细胞出现胞质膜破坏、内容物泄漏等铁死亡特征性形态变化。

Western blot分析显示，bm–Cur–NC能浓度依赖性地上调铁死亡正调控蛋白ACSL4的表达，促进多不饱和脂肪酸（PUFAs）掺入膜磷脂，为LPO提供底物。同时，bm–Cur–NC显著下调了铁死亡关键负调控蛋白GPX4和SLC7A11的表达。使用RhoNox-6探针和铁含量检测试剂盒均证实，bm–Cur–NC处理促进了细胞内Fe²⁺的积累，破坏了铁稳态。

此外，LPO介导的胞质膜破坏也影响了下述定位于膜上的耐药蛋白功能：Western blot分析显示，bm–Cur–NC处理能显著下调P-糖蛋白（P-gp）和谷胱甘肽S-转移酶（GSTs）的表达，这表明铁死亡可能有助于削弱HepG2/DDP细胞的耐药性。

诱导线粒体铁死亡

线粒体是铁死亡的重要发生器和靶点。鉴于姜黄素类化合物曾有线粒体靶向的报道，研究通过共定位实验验证了bm–Cur–NC和bm–Cur的线粒体靶向性。CLSM成像显示，两者均能与MitoTracker Red探针良好共定位（Pearson系数分别为0.75和0.82），表明它们能快速（0.5小时内）富集于线粒体。这种靶向性可能源于其α,β-不饱和酮结构与线粒体GSH发生迈克尔加成反应。

随后，研究探索了bm–Cur–NC诱导线粒体功能障碍的能力。检测发现，bm–Cur–NC处理能最有效地降低线粒体GSH水平（下降约49.1%-55.4%），并诱导最丰富的线粒体ROS生成。使用MitoPeDPP探针检测线粒体LPO发现，bm–Cur–NC处理组发出明亮的绿色荧光，表明其能诱导线粒体膜氧化和LPO积累。Western blot分析进一步显示，bm–Cur–NC能下调线粒体中的SLC7A11和GPX4蛋白表达，证实其也能抑制线粒体GSH合成并诱发线粒体铁死亡。

生物透射电镜（bio-TEM）直接观察到，bm–Cur–NC处理的细胞线粒体出现严重破坏和肿胀、膜密度增加、体积减小、嵴减少等铁死亡相关的特征性形态改变。使用MitoTracker Red CMXRos探针染色显示，bm–Cur–NC处理导致线粒体红色荧光显著消失（表明结构异常），而对照组和DDP组线粒体形态正常。JC-1探针检测线粒体膜电位（ΔΨm）发现，bm–Cur–NC处理导致JC-1单体比例显著增加（从~3%增至32.5%），表明线粒体膜电位严重耗散。此外，Western blot分析显示bm–Cur–NC处理能显著增加细胞色素c（Cyt c）的表达水平，证实其引起了线粒体外膜透化（MOMP）和Cyt c释放。这些结果综合表明，bm–Cur–NC能靶向线粒体，诱发包括线粒体氧化还原失衡、LPO、形态损伤、膜电位耗散和Cyt c释放在内的线粒体铁死亡，增强对耐药HCC的疗效。

体外抗耐药HCC疗效

鉴于bm–Cur–NC能同时诱导胞质和线粒体铁死亡，研究进一步评估了其体外抗肿瘤效果。细胞毒性实验表明，bm–Cur–NC对HepG2/DDP和HepG2细胞的24小时IC₅₀值分别为10 μg mL^?1和15 μg mL^?1。值得注意的是，在较高浓度（10-20 μg mL^?1）下，bm–Cur–NC对耐药细胞的杀伤作用强于敏感细胞。单独的Cu(II)离子对两种细胞均无显著毒性。而游离的bm–Cur对耐药细胞的 cytotoxicity 非常弱，这表明bm–Cur–NC的强大细胞毒性主要归因于其高效的三途径GSH耗竭能力所带来的耐药逆转。两者对正常肝细胞HL-7702均表现出优异的生物安全性（细胞存活率>95%），表明其对HCC细胞具有选择性杀伤作用。

活/死细胞染色实验显示，bm–Cur–NC处理组有大量红色荧光（死细胞），而对照组、bm–Cur和DDP组则以绿色荧光（活细胞）为主。流式细胞术凋亡分析进一步证实，bm–Cur–NC能以浓度依赖性方式诱导HepG2/DDP和HepG2细胞死亡，其凋亡率远高于单独的bm–Cur和DDP。

为探究细胞死亡的主要方式，研究使用了抑制剂进行挽救实验。与铁死亡抑制剂Fer-1共处理能浓度依赖性地显著提高细胞存活率（在30 μM时较bm–Cur–NC单独处理提高约20%），有效抑制了铁死亡。而与凋亡抑制剂NS-3694共处理仅能轻微提高细胞存活率（约8%），表明凋亡贡献相对较小。高浓度NS-3694甚至干扰bm–Cur–NC的杀伤效果。这些结果表明，bm–Cur–NC诱导的细胞死亡 primarily 通过铁死亡发生，凋亡起次要作用。

体内抑制HepG2/DDP肿瘤生长

基于优异的体外效果，研究在HepG2/DDP荷瘤裸鼠模型中评估了bm–Cur–NC的体内抗肿瘤功效。治疗方案为静脉注射，持续21天。在整个治疗过程中，bm–Cur–NC和bm–Cur治疗组小鼠体重变化 negligible，而DDP组小鼠体重显著下降，表明bm–Cur–NC具有良好的生物安全性。

肿瘤生长曲线显示，bm–Cur–NC治疗能有效抑制HepG2/DDP肿瘤的生长，而bm–Cur治疗效果有限，DDP则几乎不能抑制肿瘤生长。离体肿瘤照片直观显示，bm–Cur–NC组的肿瘤体积最小。肿瘤重量分析和肿瘤抑制率（TIR）计算均表明，bm–Cur–NC在5 mg kg^?1剂量下具有最低的肿瘤重量和最高的TIR，其效果显著优于bm–Cur和DDP。

组织学分析进一步证实了其抗肿瘤效果。苏木精-伊红（H&E）染色显示，bm–Cur–NC组肿瘤细胞出现大量核缺失和明显的核固缩等严重破坏；而bm–Cur和DDP组肿瘤细胞形态接近正常。TUNEL染色显示，DDP组凋亡 negligible，bm–Cur组有 limited 凋亡，而bm–Cur–NC组则出现严重的凋亡和肿瘤生长抑制。这些结果表明，bm–Cur–NC在耐药HCC模型中具有卓越的体内抗肿瘤功效，而DDP和bm–Cur效果甚微。

为探讨其作用机制，研究对肿瘤组织进行了免疫组化（IHC）和Western blot分析。IHC显示，bm–Cur–NC组中铁死亡相关因子（GPX4, SLC7A11）和耐药相关因子（P-gp, GSTs）的表达水平均低于对照组。肿瘤组织中的GSH水平在bm–Cur–NC处理后也显著降低。Western blot结果与IHC一致，证实了bm–Cur–NC通过耗竭GSH诱导铁死亡并下调耐药蛋白表达的机制。

最后，研究全面评估了bm–Cur–NC的体内生物安全性。红细胞溶血和凝血实验表明其在测试浓度下无溶血或凝血现象，具有良好的血液相容性。血液生化指标（WBC, RBC, HGB, ALT, AST, PLT, CREA, BUN）与PBS对照组无显著差异。主要器官（心、肝、脾、肺、肾）的H&E染色未发现形态学异常。与DDP（引起体重下降和肝脾损伤）相比，bm–Cur–NC不影响动物生长，也不损伤任何主要器官，表现出 superb 的生物相容性。

结论

本研究成功开发了一种新型的GSH响应性纳米治疗药物bm–Cur–NC，用于克服顺铂耐药性肝细胞癌。该纳米复合物通过“一石三鸟”策略（抑制GSH合成、Cu(II)介导的芬顿反应消耗、迈克尔加成反应消耗）协同耗竭GSH，打破氧化还原稳态，意外地同时诱导了胞质和线粒体铁死亡。bm–Cur–NC不仅在体外表现出高效的抗耐药HCC活性，还能在体内显著抑制HepG2/DDP肿瘤的生长，并使荷瘤鼠的生存时间相较于无效且有毒性的DDP治疗延长一倍。凭借其优异的水溶性、生物安全性和选择性杀伤耐药细胞的特性，bm–Cur–NC在逆转肿瘤化疗耐药方面展现出巨大的临床转化潜力，为耐药肿瘤治疗提供了一种创新的超分子策略。