胚胎生产方法与培养介质对红臀刺豚鼠胚胎发育的影响：IVF与KSOM组合优化辅助生殖技术

本刊推荐：本研究系统评估了体外受精（IVF）与人工卵母细胞激活（AOA）两种胚胎生产方法，以及钾离子优化简单培养基（KSOM）与合成输卵管液（SOF）两种培养介质对红臀刺豚鼠（Dasyprocta leporina）胚胎发育的影响。结果表明，IVF结合KSOM培养能显著提高胚胎正常形态率、卵裂速度、桑椹胚形成率，并首次在该物种中成功获得囊胚（blastocyst），为野生啮齿类动物辅助生殖技术（ARTs）的优化提供了重要理论与实践依据。

　　

引言

辅助生殖技术（ARTs）在野生动物保护中发挥着日益重要的作用，尤其对红臀刺豚鼠（Dasyprocta leporina）这类具有生态散布种子功能的南美啮齿类。尽管ARTs能够克服繁殖障碍、保存遗传多样性，但其成功高度依赖于对胚胎发育过程的深入理解。体外受精（IVF）和人工卵母细胞激活（AOA）是常用的胚胎生产方法，但先前研究中其发育成功率较低，可能与所用培养介质有关。因此，本研究旨在通过评估生产方法和培养介质对红臀刺豚鼠胚胎发育的影响，优化其ARTs体系。

材料与方法

实验设计分为两部分：一是比较IVF与AOA的效率，二是评估钾离子优化简单培养基（KSOM）与合成输卵管液（SOF）对胚胎发育的影响。卵母细胞经体外成熟（IVM）后，分为IVF组（与获能精子共孵育）和AOA组（用氯化锶和细胞松弛素B激活）。 presumed zygotes随后分别在KSOM或SOF中培养6小时，并评估形态、卵子-精子相互作用、发育动力学和氧化应激水平。

精子样本通过计算机辅助精子分析（CASA）评估动能参数，膜功能通过低渗肿胀试验（HOST）检测，膜完整性和线粒体功能通过荧光显微镜分析，DNA损伤水平通过吖啶橙染色评定，形态学通过甲醛-孟加拉玫瑰红染色评估。

卵母细胞体外成熟后，通过极体排出评估核成熟度。胚胎发育过程中，在不同时间点（D2和D5）记录卵裂率、细胞数、桑椹胚和囊胚形成情况。通过扫描电镜（SEM）观察超微结构，并通过H₂DCFDA和MitoTracker Red?检测活性氧（ROS）和线粒体膜电位（ΔΨm）。

结果

精子与卵母细胞评估

精子样本显示白色外观，平均pH 7.0，活力评分5.0（0-5 scale）。CASA分析显示总 motility（TM）为94.3%，前向运动力（PM）为72.0%，呈现高超激活状态（VCL 187.9 μm/s，ALH 5.8 μm/s）。HOST显示膜功能率为90.0%，膜完整性和线粒体功能正常率达70.0%，DNA损伤率低（完整DNA 90.3%），形态正常率达93.3%。

卵母细胞经IVM后， cumulus细胞扩张率达95.0%，第一极体（1PB）排出率达68.2%，表明成熟效果良好。

胚胎生产与体外发育

IVF来源的 presumed zygotes 正常形态率（84.5%）显著高于AOA组（63.3%）。精子-卵子相互作用无组间差异，单精受精率超93%。

发育动力学显示，在D2时，AOA-KSOM和IVF-KSOM组的卵裂结构数高于SOF组（p < 0.05），且KSOM组中≥8细胞结构比例更高。在D5时，IVF-KSOM组表现出最高的卵裂率（78.4%）和≥8细胞结构比例（87.9%），桑椹胚形成率也最高（50.0%）。值得注意的是，仅IVF-KSOM组产生了囊胚（1.3%），突显其组合优势。

氧化应激评估显示组间无显著差异，但桑椹胚的ROS和ΔΨm水平均高于 presumed zygotes（p < 0.05），可能与胚胎基因组激活和细胞数增加相关。

讨论

本研究证实IVF结合KSOM培养基是红臀刺豚鼠胚胎体外生产的最有效方法。精子高质量（高 motility、正常形态、DNA完整）和卵母细胞优化成熟是IVF成功的基础。KSOM的优越性可能源于其特定成分（如必需氨基酸、高葡萄糖和BSA）更适合啮齿类胚胎发育需求。

AOA的较低发育能力可能与父源基因组缺失有关，导致基因表达失衡和细胞周期延迟。尽管KSOM提升了AOA效果，但其效率仍低于IVF，表明父源因素在胚胎发育中不可或缺。

相比历史研究，本研究通过方法学优化（如精子选择、获能方案、培养介质选择）显著提高了红臀刺豚鼠的胚胎发育 outcomes，并首次实现囊胚形成，为该物种及近缘啮齿类的ARTs提供了重要技术参考。

结论

IVF与KSOM组合能显著改善红臀刺豚鼠胚胎的形态、卵裂动力学和桑椹胚形成，并成功突破发育阻滞，获得囊胚。KSOM的应用也优化了AOA效果。本研究不仅深化了对该物种生殖生物学的理解，也为野生啮齿类保护提供了实践方案，有助于生物多样性保护策略的推进。