嗜热菌源N-羟化单加氧酶TheA的酶学特性揭示其广谱底物适应性及生物催化潜力

本文系统表征了源自Thermocrispum agreste的N-羟化单加氧酶（NMO）TheA，发现该酶具有中度热稳定性（50°C）和罕见的立体选择性催化能力，不仅能高效催化L-鸟氨酸（L-Orn）的N5-羟基化，还对D-鸟氨酸（D-Orn）、L-赖氨酸（L-Lys）等非天然底物展现催化活性。通过构建FDH M4（甲酸脱氢酶变体）/过氧化氢酶协同体系，实现了NADPH再生和H2O2解毒，为NMOs的生物催化应用提供了新策略。

　　

引言部分

N-羟化单加氧酶（NMOs）是一类依赖黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）的氧化还原酶，利用NADPH作为电子供体催化烷基胺和氨基酸（如鸟氨酸、赖氨酸）的N-羟基化反应。这类酶广泛分布于放线菌、变形菌门和子囊菌等微生物中，参与铁载体（如去铁胺）、哌嗪酸类化合物和氮丝氨酸等次级代谢产物的生物合成。其催化机制包含还原半反应（NADPH介导的FAD还原）和氧化半反应（氧活化及底物羟基化），其中NADP⁺在反应全程结合以稳定FAD中间体。化学法合成N-羟基化合物面临氧化态控制难和反应条件苛刻的挑战，而NMOs的催化特性为生物法合成提供了新途径。

结果与讨论

序列比对与活性位点分析

TheA与已知NMOs的序列比对显示其属于鸟氨酸羟化酶家族，具有保守的FAD结合模体（GXGXXN）、NADPH结合模体（GXGQSA）和氨基酸底物结合位点。其活性位点残基Lys74、Asn250和Ser412参与底物识别，与 SidA 等同源酶类似。结构预测表明TheA以四聚体形式存在，每个单体具有独立的活性中心。

酶学特性表征

TheA在pH 7.5–8.0时活性最高，55°C时表现出最大活性，并在50°C以下保持稳定，其熔解温度约为53°C。该酶天然负载约20%的FAD辅因子，对NADPH的亲和力（K_m=0.04 mM）显著高于NADH。稳态动力学分析显示其对L-Orn的K_m为0.134 mM，k_cat为0.11 s^?1，耦合效率达81%。值得注意的是，TheA对D-Orn同样具有催化活性（K_m=4.06 mM，k_cat=0.057 s^?1），且耦合率与L-Orn相当。

反应体系优化与底物谱拓展

研究发现高浓度NADPH会增加H₂O₂副产物生成并降低羟基化效率。为此构建了包含FDH M4（NADPH再生）和过氧化氢酶（H₂O₂清除）的多酶体系。在该体系下，TheA对D-Orn、L-Lys、S-(2-氨乙基)-L-半胱氨酸（AE-Cys）和L-精氨酸（Arg）均表现出羟基化活性。LC-MS/MS分析证实了N-羟基产物的形成，其中Arg反应同时生成N-羟基鸟氨酸和N-羟基精氨酸，推测可能与胍基的水解反应有关。

活性位点突变研究

突变研究显示Asn250Ala、Asn280Ala和Ser412Ala突变均导致酶活性显著下降（最高降低50%），且完全丧失对D-Orn的羟基化能力，表明这些残基在底物识别中发挥关键作用。Lys74Ala突变体无法可溶表达，提示该残基对结构稳定性至关重要。

结论

TheA作为一种中度耐热的N-羟化单加氧酶，不仅对天然底物L-Orn表现出高效催化特性，还具备罕见的广谱底物适应性。通过酶耦合策略成功实现了NADPH再生和H₂O₂解毒，揭示了NMOs在非天然底物转化中的潜在应用价值。该研究为NMOs的酶工程改造和生物催化应用提供了重要理论基础。

实验方法

采用pET16bP载体在E. coli NiCo21(DE3)中表达His标签融合的TheA，通过镍柱亲和层析纯化。酶活性通过NADPH氧化法、羟基化产物比色法和H₂O₂检测法测定。底物筛选采用FDH M4/过氧化氢酶耦合体系，产物通过UHPLC-MS/MS（HILIC色谱柱，正离子模式）进行定性和定量分析。位点突变通过QuikChange方法实现，蛋白热稳定性通过SYPRO Orange热位移实验测定。