钾氯协同转运蛋白2活性抑制颞叶癫痫患者新皮质切片中的诱导性发作样活动

本研究发现，在颞叶癫痫（TLE）患者的癫痫传播区新皮质切片中，K+/Cl?协同转运蛋白2（KCC2）通过调节Cl?外排显著抑制诱导性发作样事件（ILEs）的生成与传播。研究采用微电极阵列和膜片钳技术，证实KCC2阻断可增强癫痫样活动，而增强其活性则抑制网络兴奋性。此外，研究揭示在Cl?负荷较高时KCC2功能受限，并提出 tonic inhibition 可能作为替代性Cl?调节机制。该研究为KCC2作为抗癫痫治疗靶点提供了重要依据。

　　

引言

颞叶癫痫（Temporal Lobe Epilepsy, TLE）是一种常见的耐药性局灶性癫痫，其发作传播机制尚不完全清楚。近年来研究发现，人类新皮质上颗粒层是癫痫在体内传播和持续的关键网络区域。K⁺/Cl^?协同转运蛋白2（KCC2）作为成年脑中最主要的Cl^?外排蛋白，通过调节Cl^?驱动力间接影响γ-氨基丁酸能（GABAergic）电流的极性和强度。然而，KCC2的净效应既可能通过Cl^?外排发挥抑制作用，也可能因伴随的细胞外K⁺浓度（[K⁺]_o）增加而产生兴奋作用，这种背景依赖性使得其在癫痫中的作用复杂且难以预测。在啮齿类模型中，KCC2阻断既报道有抗癫痫作用，也有促癫痫效应。本研究旨在深入探讨KCC2在人类颞叶新皮质癫痫传播区中的作用。

方法

研究采用36例药物耐药性TLE患者术中切除的前中颞回新皮质组织，制备急性脑切片，利用微电极阵列（MEA）在低Mg²⁺条件（0 mmol·L^?1 Mg²⁺/6 mmol·L^?1 K⁺）下诱导并记录网络活动。通过独立成分分析（ICA） pipeline 对发作样事件（ILEs）和发作间期样放电（IILDs）进行客观分析。此外，采用膜片钳技术对单个上颗粒层锥体神经元进行记录，评估KCC2功能及替代性跨膜Cl^?途径（如 tonic inhibition）。统计分析采用贝叶斯混合效应模型，以处理层次数据结构。

结果

KCC2药理学调控相反地改变人类新皮质网络活动

在低Mg²⁺/高K⁺条件下，41/72例切片诱导出ILEs，且主要发生在上颗粒层。选择性KCC2拮抗剂VU0463271（10 μmol·L^?1）的应用显著增加了ILEs的数量、空间分布、持续时间和放电频率，并可在无基线活动的切片中诱发 de novo ILEs。效应可逆，洗脱后活动减少。同样，KCC2阻断也增加了IILDs的空间分布。相反，KCC2增强剂CLP257（50 μmol·L^?1）和间接增强剂closantel（10 μmol·L^?1）显著减少了ILEs的各项参数，表明KCC2活性对癫痫样活动具有抑制作用。

Cl^?外排能力在人工增加[Cl^?]_i时受限

通过膜片钳记录，研究发现人类TLE患者上颗粒层锥体神经元在人工负载不同Cl^?浓度（19或41 mmol·L^?1）的 pipette 溶液后，均表现出体细胞和树突的GABA_A受体反转电位（E_GABA(A)）差异，证实KCC2介导的Cl^?外排功能存在。然而，当Cl^?负载增加至41 mmol·L^?1时，体细胞和树突的E_GABA(A)均去极化，且外排梯度增强但仍不足以完全恢复Cl^?稳态，表明KCC2功能在高Cl^?负荷下受限。

Tonic inhibition在长期KCC2阻断后增加

研究还发现，在长时间（>2小时）KCC2阻断后， tonic inhibition（持续GABA_A受体介导的电流）显著增加，其幅度和密度均较对照组提高。此外， tonic inhibition 的程度与自发抑制性突触后电流（sIPSCs）频率呈正相关，且在KCC2阻断后相关性增强，表明 tonic inhibition 可能作为KCC2功能受损时的替代性Cl^?调节途径。

讨论

本研究结果强调了KCC2在人类癫痫传播区中的关键作用：其功能抑制可增强癫痫样网络活动，而增强则抑制活动，表明KCC2介导的Cl^?外排在抑制癫痫发作中占主导地位。单细胞记录显示，尽管KCC2在大多数神经元中功能存在，但其外排能力在高Cl^?负荷下易饱和，可能导致体细胞[Cl^?]_i升高进而影响 perisomatic inhibition 的效能。此外， preoperative 癫痫发作频率高与KCC2外排能力降低相关，提示频繁发作可能导致KCC2功能受损。 tonic inhibition 的适应性增加可能部分补偿KCC2功能不足，但在[Cl^?]_i负荷较高时可能进一步促进Cl^?内流。

研究结果支持KCC2作为抗癫痫治疗靶点的潜力，尤其是针对癫痫传播的调控。通过增强KCC2活性或稳定其膜表达，可能恢复神经元Cl^?稳态，从而抑制癫痫活动。此外， tonic inhibition 的调节也可能成为辅助治疗策略。

作者贡献

Alice Falck 进行MEA记录；Alice Falck 和 Mahraz Behbood 分析MEA数据；Mahraz Behbood、Alice Falck、Jan-Hendrik Schleimer 和 Susanne Schreiber 开发MEA数据分析算法；Janna Lehnhoff、Egor Byvaltcev、Noah D?hne、Gabriel M. S. Janach、Alice Falck 和 Ulf Strauss 进行膜片钳记录与分析；Alice Falck 和 Annette Aigner 负责统计分析；Pawel Fidzinski、Martin Holtkamp、Julia Onken、Thilo Kalbhenn 和 Thomas Sauvigny 提供患者材料；Helena Radbruch 进行神经病理学评估；Alice Falck、Janna Lehnhoff 和 Ulf Strauss 共同撰写初稿；所有作者参与稿件编辑；Ulf Strauss、Alice Falck 和 Rudolf A. Deisz 设计并构思研究。

致谢

研究由德国研究基金会（DFG）、欧洲研究委员会（ERC）和柏林爱因斯坦基金会资助。感谢患者组织捐赠及柏林夏里特医学院人类组织组的合作。开放获取由Projekt DEAL支持。

利益冲突声明

作者声明无利益冲突。