CD8+ T细胞缺失抑制慢性应激下小鼠损伤诱导的新内膜增生

本研究发现CD8+ T细胞通过IFN-γ介导的炎症反应、蛋白水解及增殖信号通路（mTOR/Akt-p38MAPK轴）促进损伤诱导的新内膜增生。基因缺失CD8+ T细胞可显著减轻血管重塑，抑制胶原沉积、巨噬细胞浸润及炎症基因（AT1R、galectin-3、MCP-1、VCAM-1、ICAM-1）和细胞外基质重塑酶（MMP-2、MMP-9、cathepsin S、cathepsin K）表达。研究为慢性应激下血管增生性疾病提供了新的免疫治疗靶点。

　　

1 引言

近年研究表明，免疫细胞在动脉粥样硬化性心血管疾病（ACVDs）中发挥关键作用。作为适应性免疫系统的关键效应细胞，细胞毒性CD8⁺ T细胞通过黏附内皮细胞、分泌促炎细胞因子和诱导局部炎症微环境，在血管损伤相关疾病发病机制中扮演重要角色。慢性心理应激（CPS）作为外源性病理刺激，通过激活下丘脑-垂体-肾上腺（HPA）轴和交感神经系统，诱导全身炎症反应，可能通过免疫细胞调节加剧血管损伤。本研究旨在探讨CD8⁺ T细胞在应激相关血管重塑中的潜在作用。

2 材料与方法

2.1 动物

实验使用8周龄雄性野生型（C57BL/6J，记为CD8a^+/+或IFN-γ^+/+）和CD8a基因敲除（CD8a^?/?）小鼠。所有小鼠在延边大学动物实验中心特定病原体环境中饲养，实验方案经延边大学动物伦理委员会批准（协议编号YD20231212004）。

2.2 数据获取

单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据集来自基因表达综合数据库（GEO），登录号为GSE244246。对假手术和颈动脉结扎的C57BL/6小鼠颈动脉组织进行分析，通过Seurat软件包进行质量控制、标准化、整合和聚类分析。

2.3 小鼠颈动脉损伤和慢性束缚应激模型

小鼠接受颈动脉结扎加套管放置（L + C）手术，慢性应激组接受连续14天的束缚应激程序。

2.4 样本采集

术后14天采集样本，包括血液和组织。颈动脉组织分别用于蛋白质印迹、基因表达分析和病理评估。

2.5 组织学和免疫组化分析

颈动脉横截面进行H&E染色、Masson三色染色和免疫组化染色（CD68、CD8a、PCNA抗体）。使用ImageJ软件进行图像分析。

2.6 蛋白质印迹分析

提取颈动脉组织总蛋白，检测galectin-3、AT1R、p-Akt、p-mTOR、p-p38MAPK等蛋白表达水平，以GAPDH作为内参。

2.7 基因表达检测

通过实时定量PCR（qPCR）分析VCAM-1、MCP-1、ICAM-1、CatS、CatK、MMP-2、MMP-9等基因表达，以GAPDH mRNA作为内参。

2.8 IFN-γ中和实验

动脉损伤模型建立后，小鼠腹腔注射IFN-γ中和抗体或同型对照IgG。

2.9 CD8⁺ T细胞分离和过继转移

从应激IFN-γ^+/+和IFN-γ^?/?小鼠脾脏分离CD8⁺ T细胞，通过尾静脉注射到CD8^?/?受体小鼠。

2.10 细胞培养和处理

小鼠主动脉血管平滑肌细胞（VSMCs）用5%非应激血清（NS-serum）或5%应激血清（S-serum）处理24小时。

2.11 细胞迁移和侵袭实验

使用Transwell小室检测VSMCs迁移和侵袭能力。

2.12 统计分析

数据以均值±标准误（SEM）表示，使用GraphPad Prism 8.0.2软件进行统计分析。

3 结果

3.1 结扎诱导血管重塑的单细胞景观

单细胞转录组分析揭示18个转录 distinct细胞簇，T细胞与内皮细胞和VSMCs簇空间邻近。结扎损伤诱导显著的干扰素（IFN）特征并增强白细胞招募能力，表现为Ifit1/3、Stat1、VCAM1、ICAM1、Ccl7/Cxcl12等基因上调。功能富集分析显示全局差异表达基因（DEGs）和T细胞特异性DEGs显著富集于细胞外基质（ECM）组织、白细胞迁移和免疫效应调节通路。

3.2 CD8⁺ T细胞缺失减轻损伤相关新内膜增生并减少炎症

CD8a^?/?小鼠颈动脉损伤后新内膜增生显著减轻，CD8⁺ T细胞浸润减少。Masson三色染色显示CD8a^?/?小鼠胶原沉积减少，PCNA⁺增殖细胞和CD68⁺巨噬细胞数量降低。蛋白质印迹和qPCR分析显示CD8a^?/?小鼠炎症相关蛋白（galectin-3、AT1R）和增殖相关蛋白（p-Akt、p-mTOR、p-p38MAPK）水平降低，炎症细胞因子（MCP-1、ICAM-1、VCAM-1）和蛋白水解酶（MMP-2、MMP-9、cathepsin S、cathepsin K）基因表达减少。

3.3 慢性应激促进血管损伤后新内膜增生

慢性应激显著加剧CD8a^+/+小鼠颈动脉损伤后新内膜增生，CD8⁺ T细胞浸润增加。双重免疫荧光显示应激小鼠损伤动脉中IFN-γ⁺/CD8⁺ T细胞数量增加。

3.4 CD8⁺ T细胞缺失抑制应激小鼠损伤动脉新内膜增生

CD8a^?/?小鼠在应激和损伤双重刺激下血管重塑显著减轻，新内膜面积、胶原沉积、增殖细胞和巨噬细胞浸润减少。分子水平上，CD8⁺ T细胞缺失逆转了应激引起的galectin-3、AT1R、p-Akt、p-mTOR、p-p38MAPK蛋白水平升高，并抑制炎症和蛋白水解酶基因表达。

3.5 IFN-γ缺失预防应激+损伤相关新内膜增生

IFN-γ^?/?小鼠损伤动脉中galectin-3、AT1R、p-Akt、p-mTOR、p-p38MAPK蛋白水平降低。IFN-γ中和抗体减少CD8a^+/+小鼠新内膜增生和CD8⁺ T细胞浸润。过继转移实验显示，与应激IFN-γ^+/+/CD8⁺ T细胞相比，转移应激IFN-γ^?/?/CD8⁺ T细胞导致CD8⁺ T细胞浸润和重塑减轻。

3.6 CD8a^+/+小鼠S血清促进VSMCs增殖信号通路激活和迁移

CD8a^+/+-S血清促进VSMCs迁移和侵袭能力，增加p-Akt和p-mTOR蛋白水平，而CD8a^?/?-S血清这些效应被纠正。

4 讨论

本研究首次证实CD8⁺ T细胞/IFN-γ轴在损伤诱导的新内膜增生中起关键作用，特别是在慢性应激条件下。CD8⁺ T细胞缺失通过减少炎症反应、蛋白水解和增殖信号通路激活，显著改善血管重塑。分子机制涉及IFN-γ/AT1R-galectin-3和mTOR/Akt-p38MAPK轴的调控。单细胞转录组分析揭示结扎损伤激活IFN-ECM-PI3K/Akt信号轴，促进血管基质重塑和多功能CD8⁺ T细胞效应功能重编程。

慢性应激通过激活CD8⁺ T细胞加剧血管损伤，IFN-γ作为关键介质促进炎症和蛋白水解酶表达。体外实验证实CD8a^+/+-S血清通过mTOR/Akt信号通路增强VSMCs迁移和侵袭能力。

研究局限性包括动物束缚应激模型不能完全模拟人类心理应激状态，未能深入探讨IFN-γ介导的血管和炎症细胞相互作用机制。未来研究应关注CD8⁺ T细胞亚群（如Tc1、Tc2、Tc17）与巨噬细胞（M1/M2）的相互作用，以及其他免疫细胞在血管损伤中的作用。

作者贡献

Jingyuan Jin负责概念化、形式分析、调查、方法学、初稿撰写；Meiling Piao和Xianji Piao负责调查和方法学；Shangzhi Shu负责数据整理和方法学；Longguo Zhao和Zhibo Wang负责方法学和形式分析；Xueling Yue负责方法学和形式分析；Jinshun Piao负责方法学；Xianglan Jin负责审阅和编辑；Lina Hu负责监督和初稿撰写；Yongshan Nan负责验证、审阅和编辑；Xian Wu Cheng负责概念化、资金获取、项目管理、监督、初稿撰写和审阅编辑。所有作者阅读并同意文章内容。

利益冲突

作者声明无利益冲突。

伦理声明

动物研究方案经延边大学机构动物护理和使用委员会批准（协议编号YD20231212004），并按照美国国立卫生研究院实验室动物护理和使用指南进行。