HIV合并分枝杆菌感染患者外周血T淋巴细胞线粒体功能与炎症因子改变的免疫机制研究

本刊推荐：本研究深入探讨了HIV合并结核分枝杆菌（MTB）或非结核分枝杆菌（NTM）感染患者的外周血T淋巴细胞亚群、线粒体功能（线粒体质量MM及低膜电位比例MMP-low%）及炎症因子谱的特征。发现合并感染加剧T细胞耗竭与线粒体功能障碍，且HIV-NTM患者损伤更严重。研究首次揭示线粒体功能参数（CD3+CD4+CD28+ T细胞MMP-low%）与IL-2可作为预测免疫重建炎症综合征（IRIS）的潜在生物标志物（AUC=0.834, p=0.001），为HIV合并感染患者的免疫治疗提供了新视角。

　　

引言

根据世界卫生组织（WHO）2024年全球数据，全球新发结核病例达1080万例，发病率为134/10万，其中6.1%为HIV感染者，死亡病例包括16.1万HIV感染患者。HIV感染者的艾滋病期是活动性结核病的高风险阶段。此外，结核病是全球最常见的传染病之一。HIV与结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis, Mtb）共感染的协同作用加剧了疾病负担，这种协同作用的核心在于免疫功能的恶化。近年来，非结核分枝杆菌（nontuberculous mycobacteria, NTM）的发病率逐年上升，尤其在免疫受损的HIV感染者（PLWHA）中更为显著。

免疫重建炎症综合征（immune reconstitution inflammatory syndrome, IRIS）是指人类免疫缺陷病毒（HIV）感染引起的艾滋病患者开始抗逆转录病毒治疗（ART）后，机体免疫系统恢复时对现有病原体或其抗原产生的过度炎症反应。其中，结核分枝杆菌是最常见的分枝杆菌，而非结核分枝杆菌近年来越来越常见。本研究旨在探讨HIV合并分枝杆菌感染患者的免疫和炎症特征。

材料与方法

研究对象

2022年2月至2024年7月期间，杭州市西溪医院确诊的27例结核病患者和14例非结核分枝杆菌感染者，以及对照组（20例单纯HIV感染者和10例治疗后随访患者）纳入本研究。纳入标准：16岁以上、诊断为HIV合并活动性分枝杆菌感染的患者。HIV感染的诊断基于相关指南：符合以下条件之一：（1）HIV抗体筛查试验阳性，HIV补充试验阳性（抗体补充试验阳性或核酸定性试验阳性或核酸定量>5000拷贝/mL）；（2）有流行病学史或艾滋病相关临床表现，且两次HIV核酸检测阳性；（3）HIV感染者母亲所生且HIV分离试验阳性。分枝杆菌感染的诊断基于实验室数据（痰抗酸染色涂片镜检和/或痰/血/组织分枝杆菌培养和/或GeneXpert检测和/或支气管灌洗液二代测序（NGS）发现分枝杆菌）。排除标准：其他免疫疾病。收集年龄、性别、HIV-RNA、ART方案、抗NTM/TB方案、治疗前后发热持续时间、IRIS、预后及皮质类固醇或免疫抑制剂治疗等数据。淋巴细胞和细胞因子检测时机为初始感染TB/NTM时，随访组10例患者在抗感染治疗后进行检测。所有治疗前后比较排除死亡患者，仅限于接受治疗超过3个月的个体。

流式细胞术检测T淋巴细胞计数与线粒体指标

采用流式细胞术检测外周血淋巴细胞水平和线粒体膜电位（mitochondrial membrane potential, MMP）。使用NovoCyte流式细胞仪检测外周血T淋巴细胞线粒体膜电位。数据分析，检测试剂为CD3检测试剂（FITC, UCHT1）、CD45检测试剂（PerCP-Cy5.5, HI30）、CD4检测试剂（PE-Cyanine7, SK3）、CD28检测试剂（PE, CD28.2）、CD8检测试剂（APC-Cy7, SK1）[ ubiquitous Peptide Biotechnology (Zhejiang) Co. Ltd.]，检测指标：CD3⁺ T淋巴细胞（T）及其亚群CD3⁺CD4⁺ T淋巴细胞（即辅助T淋巴细胞，Th）、CD3⁺CD8⁺ T淋巴细胞（即杀伤T淋巴细胞，Tc）、CD3⁺CD8⁺CD28⁺ T淋巴细胞、CD3⁺CD4⁺CD28⁺ T淋巴细胞的绝对值、线粒体质量（mitochondrial mass, MM）、线粒体膜电位。这些染料特异性结合绿色荧光染料，后者与活细胞线粒体结合（可在633 nm激发）。图形分析见附录S1。其中，线粒体质量（MM）表示线粒体内膜呼吸链有效蛋白含量，代表免疫细胞代谢能力的实际上限，反映机体免疫的实际强度。低线粒体膜电位细胞百分比（MMP-low%）指低MMP细胞占该类细胞总数的百分比，代表免疫细胞代谢的实际状态。

流式细胞术检测细胞因子

采用双抗体 sandwich荧光发光和液相悬浮芯片技术定量检测血清中七种细胞因子，包括白细胞介素-2（IL-2）、白细胞介素-4（IL-4）、白细胞介素-6（IL-6）、白细胞介素-10（IL-10）、白细胞介素-17A（IL-17A）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）和干扰素-γ（IFN-γ）。将针对七种细胞因子（IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17A、TNF-α、IFN-γ）的单克隆抗体与不同荧光编码的磁性编码微球偶联，制备不同编码的多细胞因子磁性编码微球。将一定量微球稀释液与待测样本混合，经过第一阶段孵育后，待测样本中的细胞因子与磁性编码微球固定的抗体特异性结合，形成抗原-抗体-磁性编码微球复合物。第二阶段加入荧光蛋白标记的抗体并孵育，形成抗体-抗原-荧光蛋白标记抗体复合物。不同磁性编码微球上的荧光抗体数量可反映待测样本中各细胞因子的浓度。最后，通过分式发光分析仪捕获并解码荧光抗体信号，根据荧光信号强度和各项指标的校准曲线定量样本中各细胞因子的含量（pg/mL）。

根据诊断和治疗期间是否发生IRIS，将患者分为IRIS和非IRIS亚组。依据国际HIV相关IRIS研究网络的定义，资源有限地区结核相关IRIS的病例定义：前提：根据WHO指南在开始ART前诊断结核；开始ART前结核应已稳定或改善。临床标准：新发肿大淋巴结、冷脓肿或其他局灶性组织受累；新发或恶化的结核影像学特征；新发或恶化的中枢神经系统结核；新发或恶化的浆膜炎。排除其他原因：结核治疗失败（不依从或耐药）；其他机会性感染或肿瘤；药物毒性反应。41例HIV合并分枝杆菌感染患者排除治疗失败后，共40例分为IRIS组11例和非IRIS组19例。

统计分析

离散数据以计数（百分比）表示，连续数据以正态分布的±标准差、非正态分布的中位数和四分位距表示。使用Mann-Whitney U检验（非参数）或Student t检验（正态分布）比较连续数据之间的差异。治疗前后数据采用配对样本非参数检验。使用连续性校正的卡方检验评估分类数据之间的差异。计算受试者工作特征（ROC）曲线下面积（AUC）以评估疾病预测性能。所有统计分析使用SPSS进行，p<0.05被认为具有统计学意义。

结果

人口学特征

如表1所示，共纳入27例确诊结核病患者，包括26名男性和1名女性，平均年龄42.85±9.453岁，9/27例患者HIV-RNA低于检测线，21/27例患者接受过抗病毒治疗。27例患者中3例死亡。14例非结核分枝杆菌感染者，12名男性和2名女性，平均年龄39.00±14.11岁；14/14例患者接受过抗病毒治疗，9/14例患者HIV-RNA低于检测线。14例患者中2例死亡。对照组20例HIV感染者，包括20名男性，平均年龄39.20±11.23岁；20/20例患者接受过抗病毒治疗，20/20例患者HIV-RNA水平低于检测线下限。非结核分枝杆菌主要感染鸟胞内分枝杆菌复合体（Mycobacterium avium-intracellular complex, MAC）。所有确诊患者均接受抗分枝杆菌治疗，治疗方案因个体差异而不同。

不同组别外周血T淋巴细胞功能与炎症因子的改变

HIV-TB患者和HIV-NTM患者的CD3⁺CD4⁺ T细胞计数、CD3⁺CD4⁺ T细胞MM、CD3⁺CD4⁺CD28⁺ T细胞计数、CD3⁺CD4⁺CD28⁺ T细胞MM、CD3⁺CD8⁺ T细胞计数、CD3⁺CD8⁺ T细胞MM、CD3⁺CD8⁺CD28⁺ T细胞计数均显著低于HIV感染者（p<0.05），如表1所示。HIV-TB患者和HIV-NTM患者的CD3⁺CD4⁺ T细胞MMP-Low%和CD3⁺CD4⁺CD28⁺ T细胞MMP-Low%显著高于HIV感染者（p<0.05），如表1所示。此外，HIV-TB患者的CD3⁺CD4⁺ T细胞MM、CD3⁺CD4⁺CD28⁺ T细胞MM和CD3⁺CD8⁺ T细胞MM显著高于HIV-NTM患者（p<0.05）。CD3⁺CD4⁺ T细胞MMP-Low%和CD3⁺CD4⁺CD28⁺ T细胞MMP-Low%显著低于HIV-NTM患者（p<0.05），如表1和图1A–C所示。HIV-TB患者和HIV-NTM患者的IFN-γ、白细胞介素17A、白细胞介素2、白细胞介素4、白细胞介素6和TNFα水平显著高于HIV感染者（p<0.05），如表2所示。

T淋巴细胞线粒体功能与计数和炎症因子的相关性

我们分析了不同组别血浆炎症因子与T淋巴细胞线粒体功能和计数之间的相关性（图2）。p值<0.01的相关性被视为显著。T淋巴细胞线粒体功能与炎症因子的相关性热图如图2A–C所示。在HIV-TB患者中，炎症因子包括IFN-γ、白细胞介素-17A和白细胞介素-6与CD3⁺CD4⁺ T细胞计数、CD3⁺CD4⁺CD28⁺ T细胞计数、CD3⁺CD8⁺ T细胞MM、CD3⁺CD8⁺CD28⁺ T细胞计数和CD3⁺CD8⁺ T细胞MM呈负相关，但与CD3⁺CD8⁺CD28⁺ T细胞MMP-low%呈正相关。然而，其他组别无显著差异。

HIV合并分枝杆菌感染发生IRIS患者的外周血T淋巴细胞功能与炎症因子的改变

HIV合并分枝杆菌感染发生IRIS与否的患者在CD3⁺CD4⁺ T细胞计数、CD3⁺CD4⁺ T细胞MM、CD3⁺CD4⁺CD28⁺ T细胞计数、CD3⁺CD4⁺CD28⁺ T细胞MM、CD3⁺CD8⁺ T细胞计数、CD3⁺CD8⁺ T细胞MM、CD3⁺CD8⁺CD28⁺ T细胞计数、CD3⁺CD4⁺ T细胞MMP-Low%、CD3⁺CD8⁺ T细胞MMP-Low%、CD3⁺CD8⁺CD28⁺ T细胞MM、CD3⁺CD8⁺CD28⁺ T细胞MMP-Low%方面无统计学显著差异（p>0.05）。仅CD3⁺CD4⁺CD28⁺ T细胞MMP-Low%和白细胞介素2具有统计学显著性（p<0.05），如表3所示。

T淋巴细胞线粒体功能与炎症因子预测HIV合并分枝杆菌感染患者的IRIS

如图3所示，11例HIV合并分枝杆菌感染患者被定义为IRIS。这些患者均接受抗病毒治疗。与无IRIS组相比，联合CD3⁺CD4⁺CD28⁺ T细胞MMP-Low%和白细胞介素-2可预测HIV合并分枝杆菌感染患者IRIS的发生，AUC为0.834（p=0.001）。

HIV合并分枝杆菌感染患者治疗前后外周血T淋巴细胞亚群和线粒体功能的变化

HIV合并分枝杆菌感染患者治疗前后在CD3⁺CD4⁺ T细胞计数、CD3⁺CD4⁺ T细胞MM、CD3⁺CD4⁺CD28⁺ T细胞计数、CD3⁺CD4⁺CD28⁺ T细胞MM、CD3⁺CD8⁺ T细胞计数、CD3⁺CD8⁺ T细胞MM、CD3⁺CD8⁺CD28⁺ T细胞计数、CD3⁺CD4⁺ T细胞MMP-Low%、CD3⁺CD4⁺CD28⁺ T细胞MMP-Low%、CD3⁺CD8⁺ T细胞MMP-Low%、CD3⁺CD8⁺CD28⁺ T细胞MM、CD3⁺CD8⁺CD28⁺ T细胞MMP-Low%方面无统计学显著差异（p>0.05），如表4所示。

讨论

机会性感染是HIV感染者（PLHIV）死亡的常见原因。结核病是HIV感染者常见的机会性感染，也具有高死亡率。近年来，中国西南地区NTM分离率上升，主要见于老年患者，且HIV合并感染率高。尽管有效的联合ART，许多患者仍发展为晚期HIV感染（AHD）。在这些临床条件下开始ART的患者可能因对活动性传染源的过度免疫反应而出现矛盾性加重，这种临床状况称为IRIS，如果未及时识别和治疗，可能导致严重发病甚至死亡。我们的研究重点关注HIV合并分枝杆菌人群的免疫状态，包括IRIS的发生。

线粒体是能量细胞器，对T细胞稳态至关重要。MM和MMP-low是线粒体功能的最新指标。MM测量线粒体内膜呼吸链蛋白复合物的数量，较高水平表明ATP产生能力增强，线粒体融合和分裂动力学更强。MMP测量线粒体膜两侧的电压差，MMP水平越高，MMP-low越低，表明ATP合成增强，反映细胞的代谢活动。先前研究也探讨了HIV感染者的线粒体功能，结论是MM与不完全免疫重建（IIR）患者的关系呈U型，MM/SD<2.8存在阈值和饱和效应，与cART治疗4、5、6年后PLWH发生IIR呈负相关。在MM/SD≥2.8组中观察到的MM与IIR呈正相关，可能是由于线粒体过度激活，在潜伏HIV感染期间维持低度炎症的作用。在我们的研究中，比较HIV感染者（绝对CD4⁺ T细胞计数>200 cells/μL）与分枝杆菌感染患者，明显发现与HIV感染者相比，HIV合并分枝杆菌感染患者不仅T细胞数量更低，而且线粒体质量更低，低MMP细胞百分比更高；可能他们处于免疫抑制状态。此外，我们将分枝杆菌感染分为TB和NTM亚组。发现与HIV-TB患者相比，HIV-NTM患者的MM显著更低，低线粒体膜电位细胞百分比更高；可能HIV-NTM患者处于更严重的免疫抑制状态。这也说明了HIV合并NTM人群较差的免疫状态，可能是NTM长期潜伏感染和发生的原因。NTM是获得性免疫缺陷综合征（AIDS）背景下的典型机会性病原体。在严重免疫缺陷的宿主中更可能引起播散性或严重肺部疾病。因此，临床上显著NTM疾病的诊断本身强烈提示潜在的免疫抑制状态已经很深，可能达到晚期艾滋病水平（通常以极低的CD4⁺ T细胞计数为特征）。我们研究中观察到的更严重的MM损失和低膜电位细胞比例增加直接反映了这种更深的免疫耗竭状态，其特征是细胞能量代谢水平的T细胞功能严重受损。尽管结核病在HIV感染者（PWH）中也很严重，但结核分枝杆菌（MTB）表现出更高的致病性，可以在CD4⁺ T细胞计数相对较高（尽管仍表明免疫抑制）的PWH中引起活动性疾病。因此，HIV-TB队列的基线免疫抑制水平（诊断时）总体上可能不如HIV-NTM队列极端，这体现在观察到的相对较轻的线粒体损伤中。此外，NTM感染（尤其是鸟胞内分枝杆菌复合体–MAC）在PWH中通常遵循更慢性的过程，可能在诊断或出现严重症状前持续更长时间。这种持续的抗原暴露可导致更深刻的T细胞耗竭。因此，HIV-NTM患者可能经历更长的累积免疫系统“磨损”期，导致更严重的线粒体损伤积累。虽然TB感染也可变为慢性，但其更高的致病性常常促使更早出现症状和医疗干预。这种可能更短的治疗前疾病持续时间可能意味着免疫耗竭，特别是线粒体水平的耗竭，积累深度不如长期NTM感染中观察到的那样深。

我们还发现，在HIV-TB患者中，炎症因子包括IFN-γ、白细胞介素-17A和白细胞介素-6与CD3⁺CD4⁺ T细胞计数、CD3⁺CD4⁺CD28⁺ T细胞计数、CD3⁺CD8⁺ T细胞MM、CD3⁺CD8⁺CD28⁺ T细胞计数和CD3⁺CD8⁺ T细胞MM呈负相关，但与CD3⁺CD8⁺CD28⁺ T细胞MMP-low%呈正相关。然而，其他组别无显著差异。我们解释的核心在于活动性TB和HIV感染共同创造的 profoundly distinct immunopathological environment。这种环境的特点是：（1）极端和慢性免疫激活/炎症：HIV-TB患者经历由HIV病毒复制、结核分枝杆菌感染及其相互作用协同驱动的 relentless, high-grade inflammation。这导致促炎细胞因子（包括IFN-γ、IL-17A、IL-6）水平持续升高，远超过HIV单独感染（HIV组）通常所见水平。（2）深刻的T细胞耗竭：来自两种病原体的慢性抗原刺激导致严重的T细胞耗竭。（3）代谢失调和线粒体功能障碍：慢性炎症和免疫激活与细胞代谢重编程和线粒体功能障碍内在 linked。T细胞效应功能 critically depend on mitochondrial ATP production and biosynthetic intermediates。低线粒体膜电位（MMP）是线粒体功能受损、细胞功能障碍和凋亡易感性增加的关键指标。（4）免疫重建受损：即使在抗逆转录病毒治疗（ART）下，HIV-TB患者的免疫恢复也常次于HIV单独感染者。逆相关（细胞因子 vs. T细胞计数）：高水平的促炎细胞因子（IFN-γ、IL-17A、IL-6）是持续、强烈免疫激活和病理性炎症的标志。在这种极端环境中，这些细胞因子本身或其下游效应（如触发 activation-induced cell death (AICD)、促进耗竭、抑制胸腺输出或破坏淋巴细胞归巢）可能直接或间接导致特定T细胞亚群（如CD4⁺、CD8⁺CD28⁺）的减少或维持受损。因此，观察到的逆相关 likely reflect the depleting or suppressive effect of the pathological inflammatory milieu on the T cell pool, rather than a positive stimulatory role of these cytokines on these cells within this specific context。这种现象与人类内毒素血症中观察到的“炎症诱导淋巴细胞减少”相似和脓毒症。逆相关（细胞因子 vs. T细胞线粒体质量（MM））：MM反映线粒体含量/生物合成。逆相关可能表明慢性炎症应激抑制了T细胞的代谢适应性或促进线粒体自噬/清除，导致线粒体网络维护不良。这与肺结核和慢性炎症状态下T细胞代谢功能障碍的报道一致。关键正相关（细胞因子 vs. CD8⁺CD28⁺ T细胞低MMP百分比）：这是我们研究中最 distinctive 的发现，为病理性环境解释提供了有力支持。低MMP是线粒体功能严重受损和 pre-dysfunctional/apoptotic cellular state 的直接指标。炎症细胞因子（如IFN-γ）与表现低MMP的CD8⁺CD28⁺ T细胞百分比之间的正相关 strongly suggests that, within the extreme inflammatory context of HIV-TB co-infection, high levels of pro-inflammatory signals are not promoting the functional activation of CD8⁺CD28⁺ T cells but are instead closely associated with the dysfunction and reduced survival capacity of these crucial effector cells。这与显示耗竭T细胞常表现线粒体功能障碍的研究一致。换句话说，高度炎症环境对本应具有功能的效应T细胞施加“毒性作用”，导致其功能崩溃（表现为MMP降低），且这种崩溃程度与炎症负荷呈正相关。

此外，将患者分为IRIS组和非IRIS组后，我们发现IRIS患者的CD3⁺CD4⁺CD28⁺ MMP-Low T细胞百分比低于非IRIS组，这意味着他们的免疫状态相对活跃。也就是说，IRIS的发生不一定是不良结果。最后，配对治疗前后，分枝杆菌HIV感染患者外周血T淋巴细胞亚群数量和线粒体功能无显著差异。可见六个月内抗分枝杆菌治疗未能显著影响外周血T淋巴细胞亚群数量和线粒体功能。

由于病例数量有限和临床现象，我们的研究不可避免地存在一些局限性。首先，HIV感染者MM和MMP-low的更精确临床阈值需要大规模研究。其次，该研究是单中心前瞻性研究。本研究是一项探索性试点研究，旨在探讨T淋巴细胞线粒体功能和外周血炎症因子在HIV合并分枝杆菌感染患者中的作用。研究资源有限（时间、资金、特定人群的可及性）；招募大样本非常具有挑战性；因此采用了小样本量。然而，该研究采用前瞻性设计，实施了严格的数据收集和质量控制流程，使用金标准诊断方法确认疾病状态，并进行了详细的亚组分析以确保结果的内部有效性。需要进行大规模多中心研究并扩大 enrollment 以提供此类研究所需的更多数据。最后，对于未来的研究，我们建议进行更长期的纵向研究，以追踪HIV分枝杆菌感染患者随着抗分枝杆菌治疗时间延长，外周血T淋巴细胞亚群和线粒体功能的变化。

总之，HIV合并分枝杆菌感染患者的免疫状态显著次于单纯HIV感染者，不仅细胞数量上，线粒体状态也是如此。这种免疫状态可能与炎症的发生有关。因此，这些患者的免疫炎症机制仍需进一步探索，以帮助控制疾病的发生和治疗。