肠胶质细胞S100B通过调控肠道运动神经回路兴奋性与特异性来支配节律性结肠功能

本研究发现肠胶质细胞源性S100B蛋白是维持结肠运动复合波（CMC）的关键调节因子。通过转基因小鼠模型和钙成像技术，研究揭示了S100B通过调控肠神经元兴奋性、胆碱能神经元节律活动及神经回路功能连接性，从而支配肠道节律运动的新机制。该发现为胃肠动力障碍疾病提供了新的治疗靶点。

　　

引言

节律性运动行为是许多基本生理过程的基础，如呼吸、 locomotion、咀嚼、吞咽和发声等。这类运动模式由称为中枢模式发生器（CPG）的离散神经网络产生。CPG能自主产生节律性 timed 神经元爆发活动，从而在没有外周感觉输入的情况下产生运动活动模式。肠道运动程序如结肠运动复合波（CMC）被认为是由肠神经系统（ENS）内的CPG控制的。

新兴观点认为胶质细胞在协调CPG行为中发挥核心作用。星形胶质细胞在调节神经回路活动中不可或缺，并控制维持CPG活动所需的关键方面，如突触传递、离子平衡和能量供应。一种受到特别关注的胶质递质是S100钙结合蛋白B（S100B）。S100B是一种主要在神经系统中由胶质细胞表达的Ca²⁺结合蛋白，对细胞内和细胞外功能均发挥控制作用。

肠胶质细胞是ENS独特的神经胶质，也是肠道运动神经回路内S100B的唯一细胞来源。肠神经元和胶质细胞之间的交叉对话十分广泛，响应突触传递而实施的胶质细胞信号机制可调节 underlying 肠道运动的肠神经回路。此外，在CMC发生期间，肠胶质细胞Ca²⁺活性增加，并与神经元和varicosities的Ca²⁺活性相关。鉴于肠胶质细胞和星形胶质细胞在神经网络中的功能相似，CMC期间神经元-胶质细胞交叉对话的发生，以及肠胶质细胞富含S100B，研究人员推断S100B是肠胶质细胞调节 underlying CMC行为的肠CPG神经回路行为的可能候选者。

方法

伦理批准

所有关于人类样本的实验程序均经St. Orsola-Malpighi医院伦理委员会批准。所有动物实验均按照美国国立卫生研究院（NIH）《实验室动物护理和使用指南》进行，并获得了密歇根州立大学（MSU）机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。

人类结肠样本收集

从四名成年对照患者（两名女性，两名男性；年龄48-73岁）获取全层结肠组织样本，这些患者因非复杂性胃肠道肿瘤接受手术。

动物

在内部繁殖表达基因编码钙指示剂GCaMP5g的转基因小鼠于肠神经元和胶质细胞中。通过将B6.Cg-E2f1Tg(Wnt1-cre)2Sor/J小鼠或Chat-IRES-Cre小鼠分别与Polr2atm1(CAG-GCaMP5g, tdTomato)Tvrd小鼠杂交，生成Wnt1^{Cre2GCaMP5g-tdTom}和Chat^{CreGCaMP5g-tdTom}小鼠。实验使用8-12周龄、体重25-30克的雄性和雌性小鼠。

结肠运动复合波记录

在器官浴实验中，使用分离自Polr2atm1小鼠的结肠评估CMC。将完整的结肠收集在30-32°C的Dulbecco改良Eagle培养基/F-12中，并轻轻冲洗管腔内容物。将结肠安装在不锈钢杆上，并用手术丝线固定口端和肛端。通过手术丝线将力传感器附着在相距约2厘米的肠壁上。将组织浸没在含有Dulbecco改良Eagle培养基/F12介质的浴槽中，维持在37°C，初始张力为0.5克。在开始实验前，在LabChart 8中记录自发性CMC活动超过20分钟。CMC定义为起源于口端并向肛端传播的收缩。此适应期的最后5分钟用作分析的基线。将药物浴应用30分钟，并将由此产生的CMC振幅和积分的变化与基线进行量化。

纵向肌肌间神经丛（LMMP）全贴片制备

仔细取出结肠并保存在冰冷的Krebs溶液中。使用杆解剖法从结肠分离LMMP制备物，用于进行S100B释放测定。去除肠系膜边界脂肪，并将得到的LMMP用Krebs溶液冲洗（2 × 5分钟）以进行测定准备。

对于免疫组织化学反应，将完整的结肠沿肠系膜边界打开，并将粘膜层朝上钉在Sylgard包被的培养皿中。将组织在4%多聚甲醛中于室温固定2小时，并用磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤3次。仔细解剖粘膜、粘膜下层和环形肌层以获得固定的LMMP。

酶联免疫吸附测定（ELISA）

经过杆解剖并用Krebs缓冲液洗涤后，将LMMP在48孔板中在新鲜的Krebs或含有Arundic acid（AA）（50 μM）的Krebs中再孵育30分钟。收集培养基并在4°C下以15142 g离心力离心。收集上清液并储存在-80°C直至处理。将LMMP样品称重，在液氮中匀浆，并重悬于含有RIPA缓冲液、磷酸酶抑制剂和蒸馏水的缓冲液中，然后在4°C下以15142 g离心力离心，随后收集上清液。使用Mouse S100B/S100 Beta ELISA Kit – sandwich通过ELISA测量S100B含量。简要来说，将上清液和LMMP样品施加到预包被的试剂盒孔中，并在37°C孵育1小时。添加生物素缀合的检测抗体并在37°C孵育1小时。洗涤未结合的抗体，并添加抗生物素蛋白-辣根过氧化物酶缀合物以结合生物素，持续30分钟。洗涤未结合的抗生物素蛋白-辣根过氧化物酶，并添加3,3′,5,5′-四甲基联苯胺底物，在37°C下持续10-20分钟。监测颜色发展直至达到最佳信号，然后通过应用硫酸溶液停止。使用酶标仪在450 nm处读取光密度，并将测量值拟合到标准曲线以确定S100B浓度（pg mL^?1）。最终值通过BCA蛋白质测定法（Thermo Fisher Scientific）确定的蛋白质浓度进行校正。

免疫组织化学

将LMMP制备物用含有0.1% Triton X-100的PBS透化（3 × 10分钟），然后在含有4%正常山羊血清、0.4% Triton X-100和1%牛血清白蛋白的封闭溶液中孵育45分钟。在封闭步骤之后，将制备物与一抗一起孵育过夜。第二天，将样品在PBS中洗涤并与二抗一起孵育。最终洗涤后，使用DAPI-Fluoromount G（Southern Biotec）封片LMMP样品。每次反应均设未应用一抗的阴性对照。

荧光标记成像

使用配备20倍物镜（N.A. 0.75, Plan Fluor; Nikon）的正置落射荧光显微镜（Nikon Eclipse Ni）和Retiga 2000R相机（Qimaging）观察免疫荧光标记，该显微镜由MetaMorph版本7.10.1.161（Molecular Devices）控制。使用LSM880 NLO显微镜（Zeiss）（20倍水浸，N.A. 1.0）和ZEN 2.3软件（Zeiss）以及Stellaris 5（40倍油浸HC PLAPO CS2物镜，n.a 1.30）（Leica）获取代表性图像，该显微镜具有可调谐白光激光器和可变狭缝检测以及HyD检测器，由LAS X版本4.6.0.27096（Leica）控制。优化荧光强度的采集参数以适应每种标记。

肌间神经丛自发活动的钙成像

取出Wnt1^{Cre2GCaMP5g-tdTom}和Chat^{CreGCaMP5g-tdTom}小鼠的结肠并保存在冰凉的Krebs溶液中。使用环形肌-肌间神经丛（CMMP）制备物的全贴片进行活细胞成像。简而言之，通过显微解剖去除粘膜和纵肌以显露附着于环形平滑肌的肌间神经丛。使用配备广视野水浸20倍物镜（XLUMPLFLN20xW，1.0数值孔径；Olympus）的正置BX51WI固定载物台显微镜（Olympus）进行荧光成像。荧光激发由Lumencor AURA III光引擎（Lumencor）提供。为了激发GCaMP5g，使光通过485/20 nm带通滤波器，并使用515 nm长通滤波器过滤发射光。对于tdTomato通道，通过使光通过535/20 nm带通滤波器激发CMMP，并在检测前通过610/75 nm带通发射滤波器过滤。在来自Wnt1^{Cre2GCaMP5g-tdTom}小鼠的样品中同时成像神经元和胶质细胞活动，这些小鼠在肠胶质细胞和神经元（Wnt1+细胞）中均表达GCaMP，而使用来自Chat^{CreGCaMP5g-tdTom}小鼠的样品特异性记录胆碱能神经元活动。以2-3 mL min^?1的流速持续应用新鲜的预温（37°C）Krebs溶液。以2 Hz的帧速率记录肠神经元、胶质细胞和ChAT(+)神经元中的自发Ca²⁺活动3-5分钟。通过由MetaMorph（Molecular Devices）或NIS Elements AR版本6.10.01（Nikon）控制的Photometrics Prime BSI相机获取时间推移和显微照片。

溶液和药物

修改的Krebs缓冲液，包含（单位mM）：121 NaCl, 5.9 KCl, 2.5 CaCl₂, 1.2 MgCl₂, 1.2 NaH₂PO₄, 10 HEPES, 21.2 NaHCO₃, 1丙酮酸和8葡萄糖（用NaOH将pH调节至7.4），用于所有活体成像实验中的样品解剖、孵育和灌流。Arundic acid（溶于乙醇；Cayman Chemicals）在Krebs缓冲液中进一步稀释至最终工作浓度50 μM用于Ca²⁺成像实验和300 μM用于CMC记录。Pentamidine isethionate salt（Sigma）制备为500 μM储备溶液，并稀释至最终工作浓度10 μM用于全贴片1小时孵育和30 μM用于CMC。抗S100B抗体（EP1576Y）（Abcam）在Ca²⁺成像实验期间以1:1000稀释在Krebs缓冲液中使用，在CMC记录期间以1:1000和1:500使用。应用FPS-ZM1（Tocris）1 μM以测试CMC期间RAGE拮抗作用的效果。靶向Connexin 43的半通道阻滞剂Gap26（43Gap26; Anaspec）在蒸馏水中稀释，并在全贴片中以100 μM的工作浓度使用，孵育30分钟。Wnt1^{Cre2GCaMP5g-tdTom}全贴片在成像前孵育30分钟至1小时。Chat^{CreGCaMP5g-tdTom}全贴片经历以下顺序处理：在Krebs缓冲液中自发记录，与Arundic acid（50 μM，20分钟）孵育，冲洗（15分钟）以及与重组S100B蛋白（50 μg mL^?1；Novus Bio）孵育以验证来自相同神经节的 temporal 响应。

数据分析

对于免疫测定，每只动物被视为一个n。对于Ca²⁺成像量化，按照先前描述进行记录处理和感兴趣区域（ROI）选择。简而言之，使用Fiji软件插件对Ca²⁺成像实验的图像序列进行背景减去和对齐。使用tdTomato表达和神经元形态创建对应于单个细胞的ROI。在Fiji中计算每个ROI的平均灰度值，并在Excel（Microsoft Corp.）中计算相对荧光变化（ΔF/F₀）。如果平均响应从最大强度中减去超过第一四分位数值加上三倍标准差（SD），则认为细胞是自发活跃的。对于振幅校正，从每个细胞的最大强度值中减去第一四分位数以去除噪声。对于群体分析，每个神经节中响应细胞的相对数量被计为一个n。分析每只动物至少两个神经节。汇集数百个神经元和/或胶质细胞进行振幅和频率分析，并视为单独的n值。在适当时提供详细的小鼠、神经节和细胞n数。根据细胞响应 profile 选择代表性的Ca²⁺成像轨迹。

使用Detect软件计算功能连接性，这是一个基于MATLAB的Ca²⁺成像分析工具。将预处理的时间推移序列上传到Detect，并手动定义ROI。计算每对神经元之间的成对相关系数。使用Power Query通过逐对过滤值并应用公式：（Correlation – Min_correlation）/（Max_correlation – Min_correlation）执行成对归一化。使用Earth Mover's Distance（EMD）测量每对神经元之间的频率分布和振荡模式。类似地使用Power Query进行归一化，但使用公式：1 – (EMD – Min_EMD)/(Max_EMD – Min_EMD)。使用70%成对相关性和30% EMD的加权平均值计算全局同步。这里结合了不同的度量标准，以提供最准确和生物学相关的神经元相互作用，考虑了时间对齐和模式相似性。来自每个神经节的平均值被绘制为一个n，用于涉及基于成对相关系数、归一化成对相关性和EMD指数的聚类数量的分析。成对原始值图将一对神经元之间的每个相关值视为一个n。在说明中找到了详细的小鼠、神经节和细胞n数。热图显示来自一个代表性神经节。

统计分析

分别分析雄性和雌性小鼠，如果未观察到统计学差异则合并数据。使用Prism版本10（GraphPad Software Inc.）分析数据。Shapiro–Wilk和Kolmogorov–Smirnov检验验证数据正态性。相应地应用参数和非参数检验。对正态数据应用Student's t检验，而对非高斯数据则进行Mann–Whitney检验。对三个或更多组使用单因素方差分析Kruskal–Wallis和Dunn多重比较检验。数据表示为平均值±标准差。

结果

肠胶质细胞在肠道运动神经回路中含有并释放S100B

S100B是一种Ca²⁺结合蛋白，具有多样的细胞内和细胞外功能。其中，调节细胞兴奋性和细胞间信号传导已成为S100B在中枢神经系统CPG中的重要作用。控制肠道运动反应的肠CPG位于肌间神经丛，其中S100B在包围肠神经元的肠胶质细胞中丰富。与胶质纤维酸性蛋白（GFAP）（肌间胶质细胞 robustly 表达的标记物）和peripherin（识别大多数肠神经元的泛神经元标记物）的共标记显示，S100B在肌间神经回路中仅限于胶质细胞。这一观察结果与在S100B-GFP报告基因小鼠中观察到的表达一致，并且与在多种其他物种（包括豚鼠和人类）中观察到的表达模式一致。因此，肠胶质细胞中含有丰富的S100B是肠道运动神经回路的一个进化保守特征。

先前的工作表明，星形胶质细胞主动将S100B分泌到细胞外空间，并且多种刺激（包括神经递质/调质）可以增强星形胶质细胞S100B的分泌。从分离的肌间神经丛制备物上清液中测量S100B表明，肠胶质细胞在未受刺激的样品中也紧张性地将S100B分泌到细胞外空间。使用药物Arundic acid阻断S100B生产降低了肌间神经丛组织和上清液样品中的S100B含量。Arundic acid主要损害S100B释放，对细胞内S100B含量的影响较小。与之一致的是，尽管观察到肌间神经丛在培养基（–30%）和组织样品（–68%）中S100B释放减少，但在我们的健康样品中，Arundic acid孵育后细胞S100B表达保持不变。这些数据表明，S100B由肌间神经回路中的肠胶质细胞释放，并且Arundic acid损害胶质细胞S100B释放，而对细胞内含量的影响最小。

为了支持鼠类ENS研究对人类生理学的转化相关性，在全层人结肠横切面中标记了PGP9.5和S100B。反应揭示了结肠层和ENS的组织结构，PGP9.5标记神经元胞体和纤维，S100B仅限于周围的肠胶质细胞。这种空间组织与在小鼠中观察到的相一致，并证明S100B在肌间神经丛中仅限于肠胶质细胞。

S100B控制结肠运动复合波

CMC是由肌间神经丛中的肠CPG控制的结肠节律性运动模式。鉴于S100B控制CPG中的节律发生，并且S100B是由控制CMC的神经回路中的肠胶质细胞产生的，研究人员推测肠胶质细胞可能通过S100B对肠CPG施加控制。为了检验这一概念，研究人员通过在器官浴实验中添加选择性药物和抗体来操纵S100B的细胞内和细胞外功能，从而研究CMC活动。

与先前的工作一致，自发性CMC发生在分离的小鼠结肠中，并以口端向肛端的方向传播。当通过添加Arundic acid损害自发性S100B释放时，CMC活动几乎完全被废除。Arundic acid使口端和肛端收缩的振幅分别降低了70%和84%，收缩积分分别降低了82%和89。值得注意的是，这些效应是可逆的，在Arundic acid冲洗并返回正常培养基后，CMC活动恢复。

Arundic acid的效应表明细胞外S100B在维持肠道CMC活动中起主要作用。如果属实，那么其他操纵细胞外S100B的方法应该产生类似的效应。支持这一点的是，用抗S100B抗体（ab）清除S100B也导致CMC功能显著缺陷。S100B主要在细胞外空间通过结合Ca²⁺或通过结合晚期糖基化终末产物（RAGE）受体发挥其作用。Pentamidine是一种对S100B-RAGE轴具有广泛作用的药物，既通过直接破坏S100B的Ca²⁺/p53结合位点并限制其结合Ca²⁺的能力，也通过阻断S100B在RAGE上的配体活性。通过向浴槽溶液中添加Pentamidine（30 μM）这样做，导致CMC活动主要失败，并在口端和肛端部位仍观察到的收缩强度分别降低了82%和74%的振幅，积分分别降低了93%和85%。此外，在孵育Arundic acid、Pentamidine和抗S100B抗体后，CMC收缩位置和传播方向性失调。总之，这些观察表明CMC（一种由肠CPG控制的结肠运动行为）需要S100B，其机制可能涉及S100B的细胞外Ca²⁺结合作用。

S100B调节肌间神经回路中神经元和胶质细胞的自发活动

结肠CMC行为需要S100B的观察表明，S100B在维持控制CMC的肠神经回路活动中起作用。这些神经回路位于肌间神经丛中，由来自共同Wnt1+神经嵴祖细胞库的肠神经元和胶质细胞组成。在先前的工作中，研究人员利用这一特征在肠神经元和胶质细胞中广泛表达基因编码钙指示剂GCaMP5g，以研究它们的活动。研究人员验证了Wnt1^{Cre2GCaMP5g-tdTom}小鼠作为研究肠神经元和胶质细胞活动的有效模型，并发现肠神经元和胶质细胞之间tdTomato表达的差异有助于区分细胞类型。

神经元响应 profile 是异质性的，包括表现出大峰值、低振幅和高振幅节律性峰值以及稀疏间歇性响应的细胞，这与其他人