综述：基于ICP-MS的纳米颗粒表征进展：生物样品分析中的技术与挑战

本综述系统评述了2020年以来基于电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）的纳米颗粒（NPs）分析技术在生物样品中的应用进展。重点探讨了单颗粒ICP-MS（spICP-MS）和联用技术的原理、优势与局限，详细比较了酶提取、碱提取等样品前处理策略，并强调了多种技术联用对全面解析NPs生物行为的重要性。文章为复杂基质中NPs的精准检测与表征提供了关键方法学参考，对纳米毒理学和生物医学研究具有重要指导价值。

　　

引言

过去几十年中，纳米尺度材料的卓越特性引发了全球关注，成为基础和应用研究的热点，尤其在纳米医学领域。纳米颗粒（NPs）和纳米团簇（NCs）作为最具代表性的研究对象，其尺寸范围从1到10纳米不等。如今，NPs和NCs的关键应用涵盖强效抗菌和抗病毒剂、造影成像剂、具有增强疗效的独特药物递送载体，以及光热抗癌疗法等多个方面。然而，人体暴露于外部应用或自身产生的NPs（例如植入物的机械摩擦腐蚀）引发了监管层面的关切，涉及NPs的化学状态、毒性、生物累积性以及对从细胞培养物到动物或人类的活体生物的负面影响。

纳米尺度材料的全面表征，包括化学成分、尺寸、尺寸分布、形状、NPs浓度、团聚/聚集状态、蛋白冠形成以及其他光学、物理和磁性特性，离不开多种技术的逻辑组合。这些技术包括扫描电子显微镜（SEM）、透射电子显微镜（TEM）、动态光散射（DLS）、电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）、单颗粒电感耦合等离子体质谱（spICP-MS）、流体动力学色谱ICP-MS（HDC-ICP-MS）、场流分离ICP-MS（FFF-ICP-MS）和毛细管电泳ICP-MS（CE-ICP-MS）。与NPs合成相比，纳米医学和纳米医学组学迄今为止主要侧重于追踪NPs在生物材料中的基本特性。然而，这种追踪受到制备的液体NPs悬浮液/提取物的复杂性（NPs与其他胶体、物质的混合物）和腐蚀性特性的限制。

另一方面，开发卓越的分析技术是一项永无止境的追求，这些技术允许在不同生物基质中对金属和金属氧化物NPs进行先进的原位表征，而无需改变 incorporated NPs 性质的繁琐样品制备。基于元素/同位素特异性的ICP-MS方法，例如单颗粒方法或与分离技术联用（例如CE-ICP-MS、FFF-ICP-MS、尺寸排阻色谱[SEC-ICP-MS]和HDC-ICP-MS），是研究金属基纳米材料的最有前途的分析工具之一。

单颗粒电感耦合等离子体质谱 (spICP-MS)

近年来，spICP-MS已显示出巨大潜力，有望成为处理纳米材料（尤其是金属和金属氧化物NPs）分析和表征的实验室中的强大工具。然而，这种潜力受到几个问题的阻碍，这些问题需要在spICP-MS被认为是一种独立的颗粒核心尺寸（物理直径，排除任何表面涂层、官能团或水合层）、尺寸分布和颗粒数浓度测定技术之前得到解决。尽管如此，在各种样品类型中直接检测和表征单个NPs的优势，导致了过去5年中大约每三天就有一篇相关著作发表。

该技术的工作原理是将高度稀释的NPs悬浮液引入等离子体放电中，每个颗粒被原子化和离子化。产生的瞬态离子信号或“脉冲”对应于单个颗粒，每个脉冲的强度与NPs的质量成正比，这些脉冲的频率与颗粒浓度直接相关。通过使用定义的NPs标准（ mostly 金NPs悬浮液）进行校准，并优化样品摄取、传输效率和分析时间等参数，sp-ICP-MS可以测定NPs核心尺寸（假设颗粒组成、密度和形状—— mostly 球形）、尺寸分布和颗粒数浓度。

spICP-MS技术的频繁使用增加了对灵敏、准确、无干扰和快速的NPs表征的需求，并促使制造商推出了多种能够进行单颗粒分析的ICP-MS系统。从所有回顾的研究来看，19项研究使用了PerkinElmer的仪器，17项使用了Agilent Technologies的仪器，17项使用了Thermo Scientific的仪器，显示研究实验室在仪器制造商方面分布均匀。考虑到质量分析器：34个单四极杆（SQ）来自Agilent Technologies、PerkinElmer和Thermo Fisher；13个三重四极杆（TQ）来自Agilent Technologies和Thermo Fisher；3个飞行时间分析器（TOF）来自TOFWERK和NU Instruments；以及1个扇形场（SF）分析器来自Thermo Finnigan。

样品制备：分析的基质与提取方法

制备稳定的NPs悬浮液而不显著改变其特性甚至分散状态，是spICP-MS分析的关键步骤。值得提及的是，生物样本的收集和储存可能强烈影响检测能力和所获得NPs特性的可靠性。因此，选择合适的提取方法显著影响NPs的释放效率、溶解、团聚、样品稳定性以及整体分析性能。不同的提取技术因其对生物基质性质和NPs稳定性的适用性而异，某些方法对特定样品类型更受青睐。

在分析的样品中，动物器官或组织是最常分析的基质，显示出对NPs在动物模型中的生物累积、生物分布和潜在毒理学效应的持续研究兴趣。在14个实例中，分析了鱼类或海鲜，反映了对纳米材料工业污染水生环境的关切。人类尿液或血液在12项研究中被使用，因为它提供了一种完美且侵入性较小的方式来评估NPs暴露、其对代谢的影响以及对人群的毒理学影响。人工生物流体（五个实例）作为对照模型系统，用于模拟人体内的生理条件。

碱性提取是最常用的方法，出现在22项研究中，共有23种不同的方法学，并应用于最广泛的样品类型。通常，它用于固体样品，出现了17次（11次动物器官或组织；6次鱼类或海鲜）。然而，它也在生物流体中找到了用途，这种方法被用于人类血液或尿液三次，动物血液或粪便两次，人工生物流体一次。所有碱性提取主要使用四甲基氢氧化铵（TMAH）进行，很少使用NaOH或焦磷酸四钠（TSPP）。TMAH的浓度在各研究中从1%到25%不等；然而，最常用的浓度是20%。通常，样品在孵育前进行涡旋、超声或两者兼施，这种均质化的时间从30秒到1小时不等。孵育本身最常见的是在室温下进行24小时或过夜。

酶提取是第二最常用的方法，在15项研究中应用。它主要用于固体样品，其中8次用于动物器官或组织，6次用于鱼类或海鲜，各1次用于人类血液或尿液、人类器官或组织以及动物血液或粪便。蛋白酶K无疑是是最常见的酶，在10个案例中使用。均质化步骤包括涡旋或超声，时间从30秒到1小时。孵育通常在37°C下过夜进行。然而，也有报道称孵育时间短至15分钟，温度高达50°C。提取通常以分析前的样品稀释结束，有时样品也会被过滤。

稀释在12项研究中使用。就其性质而言，它仅适用于液体样品，因此主要用于分析人类血液或尿液和人工生物流体，仅一例分析动物血液或粪便。通常，NPs提取使用超纯水进行，稀释比例从1:10到1:100,000不等，具体取决于样品基质。

酸性提取很少使用，在综述中仅出现四次，并且仅与从固体样品中释放有关。有限的使用凸显了酸性溶解和改变金属颗粒的危险。这一缺点通常通过使用弱酸（过氧化氢或甲酸，其中一项研究使用稀释的硝酸混合物）来克服。这种提取方法可用的另一种情况是分析高度惰性的氧化物，例如TiO₂，其中一项工作使用硝酸和过氧化氢的混合物来完全溶解有机基质，只留下颗粒。

其他类别包括无法归类到上述任何类别的提取方案。在两个案例中，是直接在基质介质中进行测量，两者都是在人工肺液中进行。水溶解/释放也在另外两个案例中使用。首先，它用于评估颗粒从猪和鸡粪便中潜在释放的可能性，因此最佳提取不是目标。其次，在与酶提取法分析鲸肝中的HgSe颗粒时进行了比较，并被认为较差。另外两项研究研究了纺织品在人工汗液中的浸出。

分析的颗粒

单颗粒ICP-MS能够分析各种含金属颗粒，具有多功能性。该领域的方向可以从图中看出，近70%的已发表著作涉及Ag、Au或TiO₂ NPs。这种趋势与之前报道的相同。银和金NPs由于其明确的特性和可用性而被广泛使用。各种高质量选项，包括具有精确控制尺寸和形状的颗粒悬浮液和粉末，都可以商业化获得，使其成为方法开发的理想选择。

此外，银NPs的抗菌效果使其在医疗、制药、化妆品和服装行业有着广泛的应用。得益于其惰性和无毒特性，TiO₂纳米粉末已广泛用于化妆品、食品和医疗行业。然而，近年来，多项研究指出了其潜在的健康风险，欧盟随之在2022年1月禁止了在食品加工中使用的E171（二氧化钛）。因此，这些颗粒成为了深入研究的焦点。此外，它们的广泛使用使其易于获取，非常适合验证方法学。

只有少数研究专注于实际的原位研究，检查由于人类活动释放到环境中的这些颗粒。大多数情况下，使用Au、Ag或TiO₂ NPs的研究涉及两种不同类型的实验。首先，将样品基质（动物器官/组织或人类血液/尿液）与NPs标准品在体外混合，以验证或评估提取过程的效率。其次，通过喂食、注射或强制动物吸入某种形式的NPs，然后在动物安乐死后评估对活体生物的影响。

汞已被证明会在捕食性动物的主要器官中以高浓度积累，甚至在鲸鱼中随着年龄增长而积累。摄入的汞已被证明有潜力形成惰性的HgSe纳米结构。对生物体的影响仍存在争议。一方面，这些纳米结构的形成抑制了系统中Hg的毒性；另一方面，作为必需元素的Se的耗竭可能导致间接毒性。由于汞在捕食者中的作用和命运尚不清楚，因此分析Hg和HgSe衍生颗粒成为了解这一现象的研究人员关注的重点。

近年来，铂（Pt）NPs因其独特的结构和催化特性而引起了纳米材料科学的关注。此外，它们作为抗菌、抗真菌、抗癌等剂，在医疗环境中具有巨大的潜力。然而，由于对其潜在健康风险的日益关注，它们的使用受到限制。为了正确评估其毒性和健康危害，对Pt NPs分析和表征方法的需求日益增长。

还有十五项研究工作包含了上述之外的其他颗粒。氧化铜（CuO）NPs凭借其优异的热物理性质和相对低廉的制造成本，在半导体、电子芯片等领域找到了用武之地。在三项回顾的研究中，有两项探索了其在水生生物中的生物累积性。二氧化铈（CeO₂）NPs是多种消费品的组成部分， namely, 汽车催化剂、陶瓷和汽油。其日益增长的应用导致环境逐渐暴露，有关其健康风险的问题也随之出现。因此，检测工具变得必要。两项旨在方法学开发的工作被回顾，一项涉及基质效应，第二项比较了不同的提取方法。其他几种颗粒也在生物基质中进行了研究。

spICP-MS技术的局限性与考量

尽管spICP-MS技术已很成熟，并具有标准化方法的巨大潜力，但它仍然面临一些局限性，例如假设所有分析的颗粒都是完美的球形，即使颗粒可能具有多元素/氧化物组成，也只分析一种元素（TOF仪器除外），计算传输效率的不同方法，游离离子的持续背景以及基质衍生的干扰，缺乏合适的参考基质匹配材料等等。

小NPs的估算

spICP-MS最大的优势之一似乎是能够同时测量元素的离子形态和颗粒形态。然而，在元素离子含量可能较高的真实样品中，这可能变成一把双刃剑，显著限制该技术检测更小颗粒（大约<10纳米）的能力。这通常表现为相对较高的最小可检测颗粒尺寸限，可能导致分布图不完整。另一个负面影响是最小可检测颗粒的尺寸高度依赖于测量的元素和同位素。

尽管银颗粒是方法验证的理想候选者，因为其自然背景可忽略不计，但尚未有报道称最小可检测颗粒尺寸低于10纳米。对于更自然存在的元素如Ti或Si，最小可检测颗粒的尺寸分别攀升至48.6或350纳米。这些例子当然是回顾研究中发现的极端情况。然而，它很好地说明了这个问题。最小可检测尺寸取决于仪器对给定元素和同位素的灵敏度。

这个问题通常通过额外稀释样品以降低离子形态的浓度来处理。然而，这也有其自身的风险，即降低了进入仪器的颗粒数量。一种新颖的方法已被Fréchette-Viens等人部署，他们将Chelex-100离子交换柱直接耦合到ICP-MS进行单颗粒分析，从而更准确地测定尺寸分布，降低尺寸检测限，并减少高达95%的背景信号。迄今为止，这种有前途的方法并未被广泛使用，尤其是在生物基质的分析中。需要做更多的工作来观察这种方法是否可能成为spICP-MS分析的常规补充。

然而，所有这些都是一个更大问题的一部分，即spICP-MS数据处理。为了将颗粒信号与离子背景区分开来，需要进行统计计算以建立所谓的阈值。这个阈值是一个界限，用于区分背景信号和归因于进入仪器的颗粒的信号。如何进行此计算尚未达成一致，并且高度依赖于所使用的计算仪器。每个制造商都提供自己的软件。然而，软件如何进行阈值计算是制造商的秘密。这促使研究人员自行处理，要么使用像Origin或Excel这样的通用软件，要么使用像MATLAB和Python这样的编程语言制作自己的软件。所有可用的数据处理选项最近已由Chronakis在一项研究中总结。即使我们采用用户友好的开源软件如SPCal，它提供简单快速的单颗粒数据处理，计算变量通常也取决于研究人员的经验。

此外，还存在分析颗粒真实组成的问题。在单颗粒尺寸计算中，有必要知道颗粒的密度。当我们考虑从制造商购买的带有证书的参考材料时，这很容易。然而，当我们考虑自然存在的颗粒时，它们的确切组成纯属猜测，这再次取决于研究人员的偏好和经验。上述单颗粒数据处理的问