螺旋藻膳食补充剂中叶绿素与β-胡萝卜素的绿色分析新策略：纳米液相色谱与漫反射光谱法的综合比较与应用

本综述系统比较了两种绿色分析技术——在线管内固相微萃取-纳米液相色谱-二极管阵列检测法（IT-SPME-nanoLC-DAD）与紫外-可见漫反射光谱法（UV-vis DRS）在螺旋藻膳食补充剂活性成分分析中的性能。研究创新性地建立了仅需1.5 mL乙醇的微型化提取流程，并通过HEXAGON工具量化评估了两种方法在成分鉴定、质量控制和产品对比三大场景中的绿色性与可持续性，为功能性食品质量控制提供了兼具高效性与环境友好性的解决方案。

　　

1 引言

螺旋藻（Arthrospira maxima和platensis）作为蓝藻类微藻，因其富含叶绿素、β-胡萝卜素、酚类化合物、必需脂肪酸、维生素和易消化蛋白质等生物活性成分，在膳食补充剂市场中备受关注。其中叶绿素因其潜在抗氧化特性成为研究焦点。微藻的光合色素生产效率高于陆地植物，且可实现大规模生产。随着市场对功能性食品需求的增长，开发快速、绿色、可持续的分析方法对螺旋藻活性成分进行表征与定量具有重要意义。

目前螺旋藻中叶绿素的表征与测定主要采用紫外-可见分光光度法（UV-vis）、液相色谱（LC）联用二极管阵列检测器（DAD）或质谱（MS）、以及薄层色谱（TLC）等技术。不同研究采用的提取方法在样品量、溶剂种类、提取时间和技术上存在显著差异。本研究通过比较五种螺旋藻膳食补充剂中叶绿素和β-胡萝卜素的提取流程，从提取效率和溶剂用量角度优化提取方案。

微型化分析技术如纳米液相色谱（nanoLC）近年来逐步替代传统LC方法。nanoLC具有柱径和粒径更小、工作流程简化等优势，可实现更高分辨率和灵敏度、更短分析时间、更低溶剂消耗和能耗。该技术还可与管内固相微萃取（IT-SPME）或纳米萃取（IT-SPMNe）在线联用，根据毛细管涂层厚度（微米或纳米级）进行区分。这种联用技术在保持分辨力的同时扩展了微型化LC的样品处理量，并具有减少废物产生、提高灵敏度等优势。

研究团队前期已实现在线IT-SPME与毛细管LC（cap-LC）和nanoLC联用测定环境水样中的叶绿素，本研究进一步证明IT-SPME-nanoLC-DAD联用技术可有效区分螺旋藻（Arthrospira maxima和platensis）中的多种色素。

另一方面，紫外-可见漫反射光谱（UV-vis DRS）作为一种快速、环境友好的技术，此前主要用于叶片中叶绿素的测定，而在螺旋藻食品补充剂中的应用尚未见报道。

本研究通过HEXAGON工具对两种方法的性能指标进行综合评价。该工具采用客观标准，将评价指标分为五个板块：性能指标、毒性与安全性、废弃物、碳足迹和经济成本。每个板块的评分范围0-4分，通过正六边形图示实现分析方法的可视化比较，最终计算算术平均值（Sav）进行综合评估。HEXAGON工具符合绿色与可持续化学理念，同时平衡解决特定问题所需的性能指标，评分越低表明分析方法越符合绿色与可持续要求。

2 材料与方法

2.1 化学品与溶液

所有试剂均为分析纯级。叶绿素a（纯度95%）、叶绿素b（纯度95%）和β-胡萝卜素（纯度95%）购自Sigma-Aldrich公司。HPLC级乙醇购自VWR Chemicals公司。

分析物储备溶液（1000 μg/mL）通过将适量标准品溶解于乙醇制备。工作溶液通过用乙醇或水稀释储备溶液制备（最终乙醇浓度为20% v/v）。超纯水由Adrona系统制备。所有溶剂在使用前经GVS公司0.22 μm尼龙膜过滤。所有溶液避光4°C保存直至使用。

2.2 色谱条件

NanoLC系统为Agilent 1260 Infinity，配备由Rheodyne 7725i 6位手动进样阀与VICI C2N 10位2通自动阀组成的进样系统，以及UV-vis DAD检测器。标准溶液通过阀内IT-SPME在线富集，使用涂覆有二氧化硅纳米粒子掺杂的四乙氧基硅烷（TEOS）-三乙氧基甲基硅烷（MTEOS）聚合物的熔融石英毛细管（10 cm × 75 μm i.d.）。毛细管内部形成均匀的TEOS-MTEOS涂层（350 nm）。

IT-SPME通过图1所示设置与分析柱（Agilent Zorbax 300SB-C18，5 cm × 75 μm i.d.，3.5 μm粒径）联用。分析流程始于将标准品或样品从手动阀（V1）加载到自动阀（V2），V2包含IT-SPME毛细管。在富集阶段，分析物保留在毛细管涂层上，剩余溶液在色谱分离前导入废液。同时，分析柱进行条件化（图1位置A）。随后在位置B，粗IT-SPME提取物从自动阀V2注入色谱系统，获得检测信号。

色谱分离采用等度洗脱模式，以乙醇-超纯水（EtOH/H₂O 95:5% v/v）为流动相，流速0.5 μL/min。将100 μL工作溶液通过V1手动注入IT-SPME毛细管系统（使用250 μL精密注射器）。样品加载完成后，自动阀旋转切换位置，使保留的分析物被流动相洗脱至分析柱。

分析信号在400-800 nm范围内记录，叶绿素a监测662 nm和420 nm，叶绿素b监测662 nm和450 nm，β-胡萝卜素监测450 nm。检测器连接Agilent ChemStation数据进行采集和处理。所有实验在20 ± 2°C室温下进行。

2.3 光谱条件

紫外-可见漫反射光谱使用Agilent Cary 60 UV-vis光谱仪配备Harric Scientific Products漫反射探头测定。光谱记录范围200-800 nm，叶绿素a监测662 nm和420 nm，叶绿素b监测662 nm和450 nm，β-胡萝卜素监测350 nm和450 nm。使用CaryWinUV软件进行数据采集和处理。测量过程直接将50 μL标准乙醇溶液或螺旋藻platensis乙醇提取物施加于Millipore玻璃纤维滤膜（13 × 1.2 mm），在弱光环境下立即测量。

2.4 提取流程

对膳食补充剂（1 mg和10 mg）进行了五种色素提取方案（A、B、C、D和E），如表1所示。提取过程通过涡旋振荡1分钟，随后超声浴5分钟辅助进行。获得的上清液经0.2 μm × 13 mm尼龙膜过滤，并用水稀释确保最终乙醇含量调整为20% v/v，通过IT-SPME-nanoLC-DAD处理。必要时调整乙醇体积以维持此比例。

使用琥珀色材料防止光照。样品和标准品在同日制备，提取后立即进样。

2.5 螺旋藻样品

分析了从当地市场购买的七种螺旋藻产品。各产品标签详细信息总结于表2。该表同时显示了提取流程E（见表2）的称样量和IT-SPME-nanoLC-DAD采用的稀释因子。对提取物进行三次重复测量，UV-vis DRS直接测量玻璃纤维滤膜上的样品，IT-SPME-nanoLC-DAD用水稀释并维持乙醇含量20%。表3显示了微藻种类。产品S1为粉末状，其余为胶囊形式。

为最大限度减少光降解，每个样品储存于琥珀色EP管中，室温避光保存以保持完整性确保分析准确性。

通过首次提取的螺旋藻样品（含有微量分析物）评估基质效应。向这些样品中添加浓度为50 μg/L的叶绿素a和β-胡萝卜素标准溶液，以及100 μg/L的叶绿素b标准溶液。

3 结果与讨论

3.1 IT-SPME联用nanoLC-DAD的性能指标

图1所示的nanoLC系统用于所有实验。图2显示了300 μg/L叶绿素b和a以及200 μg/L β-胡萝卜素标准溶液在662 nm和450 nm的色谱图。插图显示了各色谱峰最大值处的归一化光谱。在0.5 μL/min流速下，运行时间少于8分钟。

通过处理分析物标准溶液获得校准曲线。对于样品处理，需考虑从补充剂提取流程中获得的色素回收率（后续说明）。通过处理20%乙醇溶液制备的五个浓度叶绿素a、叶绿素b和β-胡萝卜素标准溶液（每个浓度重复两次）评估仪器线性。各浓度的两个值统计学相似（y = x，R² = 0.99）。所有校准线的R²值表明峰面积与不同色素浓度间具有良好的相关性（表3）。从样品部分的峰纯度分析可获得选择性和无显著基质效应的充分证据，从而支持使用标准溶液进行外部校准（若获得接近1000的值）。

通过逐步注入更低浓度的稀释标准溶液（始终保持20%乙醇）直至信噪比达到3和10，分别获得检测限（LOD）和定量限（LOQ）。这些值见表3；LOQ为工作浓度范围的下限值。日内精密度（相对标准偏差百分比RSD%）也符合要求，为2%-3%。日间精密度为5%-8%。

3.2 紫外-可见漫反射光谱的性能指标

使用乙醇中的叶绿素a、叶绿素b和β-胡萝卜素标准品构建校准曲线。每种叶绿素标准品观察到两个吸收最大值。叶绿素a在约430 nm和660 nm处出现峰值，叶绿素b在约470 nm和650 nm处显示最大值。β-胡萝卜素的吸收最大值出现在约350 nm。获得的光谱如图3所示。

通过直接测量玻璃纤维滤膜上的标准溶液（见图3插图）评估漫反射线性。处理叶绿素a、叶绿素b和β-胡萝卜素的三个浓度（每个浓度重复两次）。对于样品处理，需考虑从补充剂应用的提取流程中获得的色素回收率（后续说明）。LOD和LOQ通过十个空白信号的标准偏差获得（见表4）；LOQ为工作浓度范围的下限浓度。日内精密度（RSD%）为2%-6%，日间精密度（RSD%）为5%-9%。这些RSD%值符合要求。

3.3 提取流程研究

对样品S1测试了表1所示的提取方案，选择叶绿素a作为研究对象（因其在样品中含量较高）。测试了螺旋藻platensis的连续乙醇提取，直至提取液无色。使用IT-SPME-nanoLC-DAD技术确认每次提取叶绿素a的存在，直至低于LOD。建立了五种方案（A、B、C、D和E），策略是最小化提取次数、样品量和乙醇用量。A和B分别使用总乙醇体积2.2 mL和1.4 mL，测试了多次提取体积对色素回收率的影响。C和D评估了样品量的影响，保持提取次数和体积不变，总乙醇体积4.5 mL。E与A相似，但提取次数减少。图4显示了各提取方案（A、B、C、D和E）每次提取步骤回收的叶绿素a量，X轴代表每次提取步骤，Y轴表示回收的叶绿素a量。图5显示了每个方案回收的叶绿素a总量。A和E在前两个步骤中提供的色素回收率高于B、C和D。

样品S1在提取A、B、C、D和E中叶绿素a的累积值分别为：4.01 ± 0.92、4.1 ± 0.2、4.6 ± 0.2、4.7 ± 0.4和4.7 ± 0.2 mg/g（图5）。所有提取获得的分析物量相对相似。提取C和D使用了显著更多的溶剂（4.5 mL乙醇）和更多的提取循环次数（总共九次），而提取A、B和E分别使用了2.2、1.4和2.1 mL乙醇。但提取E仅需两个提取循环即可获得相当的结果，表明可通过更少步骤和更少溶剂实现更高效的提取过程。选择方案E的前两个提取（1.5 mL）处理样品。

表5显示了文献中发布的不同螺旋藻叶绿素提取流程。可见文献提出了差异巨大的样品数量、溶剂、时间和技术。本研究开发的提取方法使用环境友好的乙醇溶剂最少，样品量约1 mg。

3.4 螺旋藻platensis膳食补充剂：色素组成、质量控制和产品比较

通过IT-SPME-nanoLC-DAD从首次提取的螺旋藻样品（含有微量分析物）评估基质效应，这些样品添加了50 μg/L叶绿素a和β-胡萝卜素，以及100 μg/L叶绿素b。获得的结果（表6）表明无基质效应，表明可通过外部校准进行而不影响浓度估算的准确性。

图6显示了使用提取流程E处理的所有样品（S1-S7）第二次提取物的色谱图，该流程提供了色素的最大提取（见图5）并经过适当稀释。叶绿素A的峰纯度为：979（S1）、963（S2）、961（S3）、987（S4）、978（S5）、978（S6）和926（S7）；β-胡萝卜素为：989（S3）和971（S4）。这些值表明基于DAD检测器选择性的外部校准可提供合适的结果。

通过nanoLC仪器软件获得的4σ（ω）处峰宽平均值为：0.39 ± 0.06分钟（n = 9），符合系统设计的固有权衡（见图2），优先考虑提高检测限和最小化溶剂消耗，符合绿色分析方法。IT-SPME-nanoLC联用允许向分析柱注入433 nL处理过的样品或标准品，系统总体积为713 nL（图2所示），具有合适的分辨率。

测试样品中最主要的成分是叶绿素a，通过其光谱和保留时间（与图2一致）鉴定，这与文献一致，因为叶绿素a是螺旋藻platensis中的主要色素。此外，样品S1、S2、S3和S4还含有一种文献报道的微藻叶绿素化合物。图6插图显示了在其色谱峰最大值处获得的光谱，命名为未知叶绿素，与文献中给出的光谱相似。样品S5、S6和S7未显示该化合物存在。在样品S3和S4中检测到β-胡萝卜素；但在样品S3中，其浓度接近LOQ，而在样品S4中较高。此外，样品S3-S7显示了其他类胡萝卜素的存在，通过其特征光谱信号指示。但由于缺乏分析标准品，这些化合物无法明确鉴定。尽管需要预先稀释且这不是直接测量技术，但其高灵敏度和识别多种目标化合物的能力使其成为成分研究的理想方法。表7显示了所有样品估算的色素组成。样品中叶绿素a的量在4.7 ± 0.2至7.1 ± 0.3 mg/g之间，与文献报道和使用本研究中提出的IT-SPME技术发现的值相似。

图7显示了测试样品的漫反射光谱。样品S1、S2和S3的光谱与叶绿素a光谱一致（图3）。这些结果与图6的色谱图一致，S1和S2仅含叶绿素，S3也含有低浓度的β-胡萝卜素（见表7）。S4、S5、S6和S7的光谱显示叶绿素和类胡萝卜素的混合光谱，这也与其色谱图一致。

漫反射光谱可提供色素总浓度（此处表示为叶绿素a）。获得的结果显示在表7中。

IT-SPME-nanoLC-DAD和UV-vis DRS方法已通过认证可解决不同测试问题（根据各自可提供的分析结果）：建立叶绿素和β-胡萝卜素的组成、质量控制和商业产品比较。图8表明IT-SPME-nanoLC-DAD可用于解决的三个既定问题。然而，考虑到LC方法获得的HEXAGON工具以及UV-vis DRS对应的工具，第二种方法更可持续和绿色。HEXAGON工具，如引言部分所述，符合绿色与可持续化学理念，同时平衡解决给定问题所需的性能指标。通过定义罚分（PPs）评估客观标准，分为五个不同板块：性能指标、毒性与安全性、废弃物、碳足迹和经济成本。每个板块的总评分范围0-4分，通过正六边形图示实现分析程序的用户友好比较，最终计算算术平均值（Sav）进行综合评估。图9显示了HEXAGON工具采用的几个变量的每种方法的PPs。UV-vis DRS方法在大多数分析类别中显示较低罚分，特别是在毒性、废物产生、碳足迹和年度成本方面，突显其环境友好特性。因此，尽管IT-SPME-nanoLC-DAD方法为复杂基质（如螺旋藻）的组成分析提供了更高的分辨能力，但UV-vis DRS方法代表了特定目的（如常规质量控制和产品比较）的更绿色替代方案，如图8所示。这使得不仅基于分析性能，而且考虑环境影响和实际可行性选择最合适的方法成为可能。

4 结论

螺旋藻platensis中叶绿素和β-胡萝卜素的提取效率与文献报道的其他方法相比相当高效。其突出特点在于所需样品量小、溶剂用量极少、时间短、以及提取样品中叶绿素所需的提取次数少。

本研究通过IT-SPME联用nanoLC-DAD和UV-vis DRS评估了螺旋藻platensis中叶绿素的测定。IT-SPME-nanoLC-DAD实现了叶绿素和β-胡萝卜素的快速分析（少于8分钟）、低能耗和最小溶剂使用。该方法表现出良好的线性和准确性，具有令人满意的日内和日间精密度。其显著特点在于流动相使用的溶剂用量极少，以及相对于传统LC更快的分析时间。IT-SPME-nanoLC-DAD提供高灵敏度和检测多种分析物的可能性。漫反射是一种快速高效的技术。其可持续性、环境友好性和易用性也值得注意，经HEXAGON工具认证。该技术为复杂混合物的表征提供了全面方法，使其对多组分样品的详细分析非常宝贵。LC方法可用于响应建立叶绿素和β-胡萝卜素的组成、质量控制和商业产品比较。同时，UV-vis DRS可用于质量控制和产品比较。